D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fytopatogenní houba Colletotrichum coccodes způsobuje v bramborách a rajčatech nebezpečné choroby známé jako antraknóza a černá skvrna hlíz. Podle morfologických charakteristik je často obtížné je odlišit od nemocí způsobených jinými mikroorganismy; na zelených rajčatových plodech může být onemocnění asymptomatické, projevující se pouze na zralých červených plodech. Pro rychlou a přesnou diagnostiku patogenu je nabízen testovací systém PCR v reálném čase. Pro vývoj testovacího systému byla stanovena nukleotidová sekvence genu glycerol trifosfát dehydrogenázy 45 C. kodokóduje kmeny izolované z hlíz bramboru v různých oblastech Ruska.
Na základě získaných výsledků a analýzy podobných sekvencí jiných druhů dostupných v databázi GenBank byly navrženy druhově specifické primery a sonda pro C. coccodes. Pro ověření specificity vytvořeného testovacího systému byla provedena PCR s DNA izolovanou z čistých kultur 15 různých druhů parazitických a saprotrofních hub spojených s rostlinami rajčat a brambor (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Přítomnost DNA kódů Colletotrichum byla stanovena při prahovém cyklu 20–27, zatímco jiné druhy byly detekovány po 40 cyklech nebo nebyly detekovány. Testovací systém umožňuje spolehlivě detekovat koncentrace C. coccodes DNA přesahující 0.01 ng / mm3 v analyzované směsi PCR. Použitím vyvinutého testovacího systému byla zjišťována přítomnost C. coccodes v listech rajčat s příznaky plísňových onemocnění a v hlízách brambor bez vnějších příznaků choroby. Listy s příznaky plísňové infekce byly shromážděny ze dvou různých polí v regionu Krasnodar, hlíz - z polí v oblastech Kostroma, Moskva, Kaluga, Nižnij Novgorod. Jeden list rajčete obsahující DNA C. coccodes byl nalezen na území Krasnodar; významná přítomnost DNA tohoto patogenu byla detekována v 5 vzorcích hlíz pěstovaných v oblastech Kostroma, Moskva, Kaluga.
úvod
Houby rodu Colletotrichum jsou nebezpečné fytopatogeny ovlivňující obiloviny, zeleninu, byliny, vytrvalé ovoce a bobuloviny. Jeden ze všudypřítomných druhů tohoto rodu, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, je původcem antraknózy a černé skvrny od brambor a rajčat, způsobující nemoci řady dalších rostlin čeledi Solanaceae, vč. plevele (Dillard, 1992). C. coccodes infikuje všechny podzemní části rostliny, stonky, listy a plody (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Na slupce infikovaných hlíz bramboru je pozorován vývoj šedých skvrn s nezřetelně výraznými okraji, na kterých jsou jasně viditelné černé tečky sporulace a mikrosklerotií. Během skladování se v dužině hlíz mohou tvořit vředy se změkčeným obsahem, tj. nemoc vstupuje do antracnózové fáze, která je však extrémně vzácná.
Současně jsou na plodech rajčat typické příznaky antraknózy (kožní vředy s malými černými tečkami). Na listech se příznaky C. coccodes objevují jako tmavě hnědé skvrny, obvykle ohraničené žlutou tkání (Johnson, 1994).
Vývoj černé skvrny na hlízách kazí jejich vzhled, což je zvláště výrazné při prodeji umytých brambor s červenou slupkou. Peelingová exfoliace vede k nadměrnému odpařování a zvýšeným ztrátám při skladování (Hunger, McIntyre, 1979). Poškození jiných rostlinných orgánů vede ke ztrátám výnosu, které byly zaznamenány v otevřené i uzavřené půdě (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Nemoci způsobené kódováním C. jsou běžné téměř ve všech regionech světa produkujících brambory, včetně Ruska (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrola těchto chorob je obtížná kvůli nedostatečné účinnosti stávajících fungicidů proti C. coccodes a nedostatku rezistentních odrůd (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes může přetrvávat v hlízách semen (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), semenech rajčat (Ben-Daniel et al., 2010), přežít po dlouhou dobu v půdě na rostlinných zbytcích (Dillard, 1990 (Dillard, Cobb, 1993) a u plevelů (Raid, Pennypacker, 1987). Práce řady autorů (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ukázaly, že vývoj choroby u brambor a rajčat do značné míry závisí na přítomnosti inokula v semeni a půda. Proto, aby se minimalizovaly ztráty způsobené chorobou, je nutné diagnostikovat (včetně kvantitativního) rozmnožování houby v semenném materiálu, v půdě, v semenných bramborových hlízách a semenech rajčat určených k uskladnění. Morfologickou diagnostiku v půdě a rostlinném materiálu lze provádět pouze za přítomnosti mikrosklerotií, které se však vyskytují i u jiných druhů hub.
Příznaky na hlízách jsou velmi podobné stříbřitému strupům způsobenému houbou Helminthosporium solani. Izolace kódů Colletotrichum a Helminthosporium solani do čisté kultury je poměrně obtížná a trvá dlouho kvůli pomalému růstu na živném médiu. K rychlé identifikaci kódů Colletotrichum je nutné použít instrumentální diagnostické metody. Nejvhodnější metodou je polymerázová řetězová reakce (PCR) a její modifikace - real-time PCR. V současné době se v Evropě a ve Spojených státech používá testovací systém vyvinutý britskými vědci (Cullen et al., 2002) pro oblast ITS1 rDNA. Jeho použití ukázalo dobré výsledky v analýze ruských izolátů (Belov et al, 2018). C. coccodes je však vysoce variabilní a jeho detekce z jediné sekvence DNA může vést k falešně negativním výsledkům. Pro spolehlivější diagnózu je nutná analýza několika druhově specifických sekvencí DNA, v souvislosti s nimiž jsme vyvinuli originální testovací systém, který umožňuje identifikaci C. coccodes podle sekvence genu pro glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu.
Materiály a metody
K posouzení účinnosti a specifičnosti vytvořených testovacích systémů jsme použili čisté kultury 15 druhů hub izolované autory z postižených vzorků listů a plodů rajčat, bramborových hlíz (tabulka 1). Pro izolaci byly odebrány orgány rostlin s příznaky houbové infekce, ne více než jeden orgán na keř.
Plátek hlízy se slupkou, plátek rajčatového ovoce a postižený list byly umístěny pod binokulární mikroskop, načež bylo mycelium, výtrusy nebo kousek tkáně přenesen na agarové médium (mladinový agar) v Petriho misce s naostřenou pitevní jehlou. Izoláty byly skladovány na agaru nakloněném ve zkumavkách při 4 ° C.
Vzorky listů rajčat pro analýzu s příznaky houbových chorob bezprostředně po sklizni (na poli) byly umístěny do 70% ethylalkoholu, ve kterém byly uchovávány až do izolace DNA. Bramborové hlízy byly dodány do laboratoře, odloupnuty (2 x 1 cm kus) z nich a zmraženy na –20 ° С. Skladovány zmrazené až do izolace DNA.
Čisté kultury hub pro izolaci DNA byly pěstovány v kapalném médiu hrachu. Mycelium houby bylo odstraněno z kapalného média, vysušeno na filtračním papíru, zmraženo v kapalném dusíku, homogenizováno, inkubováno v pufru CTAB, vyčištěno chloroformem, vysráženo směsí isopropanolu a 0.5 M octanu draselného, dvakrát promyto 2% alkoholem. Výsledná DNA byla rozpuštěna v deionizované vodě a uložena při –70 ° C (Kutuzova et al., 20). Koncentrace DNA byla měřena pomocí soupravy pro kvantifikaci HS DNA pro dvouvláknovou DNA na Qubit 2017 (Qiagen, Německo). Alkoholizované a zmrazené vzorky byly triturovány v kapalném dusíku, poté byla provedena extrakce DNA, jak je popsáno výše (pro mycelium čistých houbových kultur).
Tabulka 1. Původ použitých kmenů hub
Název hub | Rostlina, orgán | Místo výběru |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | bramborová hlíza | Oblast Kostroma, hlízy brambor 1. polní generace, kultivar Red Scarlett |
Colcotrotumum coccodes 4 | bramborový list | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | bramborová hlíza | Magadanská oblast, poz. Stan, bramborová hlíza |
Cladosporium fulvum | rajče list | Moskevská oblast, velkoplodé rajče |
Alternaria tomatophila | rajče ovoce | předáno pracovníky laboratoře mykologie a fytopatologie Všeruského výzkumného ústavu ochrany rostlin |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | rajče ovoce | Krasnodarské území, okres Krymsky, stupeň Cream |
Fusarium oxysporum | kořen pšenice | Moskevský kraj |
PCR byla provedena na zesilovači DTprime (DNA-Technology). Pro PCR byly použity originální primery a sonda pro druhově specifickou oblast genu glycerol trifosfát dehydrogenázy: přímý primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverzní primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1, sonda Primery amplifikují oblast 213 bp.
Reakce zabrala 50 ng celkové DNA (při analýze listů a hlíz) a 10 ng (při analýze DNA čistých houbových kultur). Reakční směs (35 μl) byla rozdělena parafinovou vrstvou na dvě části: spodní (20 μl) obsahovala 2 μl 10 × reakčního pufru (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM každého deoxynukleotid trifosfátu, 7 pmol každého primeru a 4 pmol hydrolyzovatelné fluorescenční sondy; horní obsahoval 1 μl 10 × PCR pufru a 1 U Taq polymerázy.
Oddělení směsi parafinem umožňuje zkumavky dlouhodobě skladovat při teplotě 5 ° C a zajistit horký start pro PCR po jejich 10minutovém zahřívání na teplotu nad 80 ° C. PCR byla prováděna podle následujícího programu: 94.0 ° C - 90 s (1 cyklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cyklů); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cyklů); 10.0 ° C - skladování.
Výsledky a diskuse
Sekvence genu pro glycerol trifosfát dehydrogenázu byly stanoveny u 45 kmenů izolovaných z listů, stonků, bramborových hlíz a plodů rajčat (Kutuzova, 2018) v různých oblastech Ruska. Studované sekvence všech kmenů byly rozděleny do 2 skupin lišících se dvěma nukleotidy. Nukleotidové sekvence zástupců obou skupin pod čísly KY496634 a KY496635 jsou uloženy v GenBank.
Primery coc70gdf, coc280gdr a sonda cocgdz navržené na jejich základě byly zkontrolovány pomocí programu BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na všech sekvencích genu glycerol trifosfát dehydrogenázy druhů rodu Colletotrichum a dalších organismů dostupných v databázi GenBank.
Nebyly nalezeny žádné oblasti DNA jiných organismů vysoce homologních s primery a sondou.
Citlivost testovacího systému byla kontrolována pomocí vzorků s různými koncentracemi DNA C. coccodes, DNA bramborového listu infikovaného antraknózou (shromážděné v roce 2017 v Mari El, odrůda Red Scarlett) a slupky hlíz postižených černou skvrnou (shromážděné v oblasti Kostroma, odrůda Red Scarlett, tabulka 2). K potvrzení přítomnosti DNA v hlízách a bramborových listech byly z nich izolovány kmeny C. coccodes do čistých kultur.
Výsledky analýzy citlivosti testovacího systému ukazují, že jej lze použít k úspěšné diagnostice přítomnosti C. coccodes DNA ve vzorku, pokud je jeho celkový obsah ve směsi PCR vyšší než 0.05 ng. To je pro detekci zcela dostačující, protože jedna sklerotie obsahuje v průměru 0.131 ng a jedna spóra obsahuje asi 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testovací systém vyvinutý anglickou skupinou (Cullen et al., 2002) vykazoval podobnou citlivost (prahový cyklus 34 při 0.05 ng DNA a 37 při 0.005 ng).
Analýza přírodních vzorků obsahujících C. kódovací kódy ve všech případech umožnila spolehlivě odhalit jeho přítomnost ve vzorku (tabulka 2). Navrhovaná metoda izolace DNA byla použitelná také pro analýzu vzorků přírodních rostlin.
Tabulka 2. Stanovení citlivosti navrhovaného testovacího systému pro identifikaci kódů Colletotrichum pro PCR v reálném čase
Vzorek | Množství DNA ve vzorku *, ng | Prahový cyklus | C. Detekce kódovacích kódů |
---|---|---|---|
Kóduje Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Slupka hlízy 1 | 50 | 32 | + |
Slupka hlízy 2 | 50 | 30 | + |
Slupka hlízy 3 | 50 | 31.5 | + |
Bramborový list | 50 | 29.5 | + |
Poznámka. * Ve směsi produktů PCR.
Specifičnost testovacího systému byla testována na vzorcích DNA extrahovaných z 15 druhů hub. Všechny kmeny hub byly autory izolovány z postižených a zdravých plodů a listů rajčat, hlíz brambor; jeden kmen byl izolován z pšeničného kořene (tabulka 1). Mezi druhy izolovanými z povrchu plodů existují i druhy, které nejsou pro rajčata patogenní (například Phellinus ferrugineovelutinus).
Studie ukázaly, že DNA C. coccodes byla detekována v prahovém cyklu 20–27, zatímco jiné druhy hub nebyly detekovány, nebo poskytly signál po cyklu 40, což lze přičíst účinkům nespecifického šumu (tabulka 3).
Tabulka 3. Kontrola testovacího systému na různé druhy hub
Název hub | Prahový cyklus |
Kódy Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. kódování 2 | 22.6 |
C. kódování 3 | 23 |
C. kódování 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodoncium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Poznámka. * Množství DNA ve všech vzorcích bylo 10 ng.
Vyvinutý testovací systém byl použit k identifikaci C. coccodes ve vzorcích listů rajčete s příznaky nekrotrofních patogenů a semenných hlíz bramboru bez viditelných příznaků. Pro studii jsme vzali hlízy semen různých odrůd pěstovaných v oblastech Kostroma, Moskva, Kaluga, Nižnij Novgorod. Přítomnost DNA C. coccodes byla považována za významnou ve vzorcích, při jejichž analýze prahový cyklus nepřekročil 35. Tato prahová hodnota byla vybrána na základě spolehlivého stanovení 0.05 ng DNA C. coccodes (prahový cyklus 33.5, tabulka 2) a skutečnosti, že prahové cykly nad 40, byla diagnostikována nespecifická DNA některých jiných druhů hub. S tímto přístupem byla detekována významná přítomnost DNA C. coccodes v 5 vzorcích hlíz pěstovaných v oblastech Kostroma, Moskva, Kaluga a v jednom listu rajčete z oblasti Yeisk v Krasnodarském regionu (tabulky 4, 5).
Tabulka 4. Detekce kódů Colletotrichum na hlízách brambor *
Číslo vzorku | Rozmanitost brambor | Místo růstu | C. Detekce kódovacích kódů | Prahový cyklus |
---|---|---|---|---|
1 | Červená šarlatová | Kostromská oblast | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskevský kraj | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovský časně | Moskevský kraj | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga region. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasy | Kaluga region. | - | |
15 | Gala | Nižnij Novgorod region. | - | |
16 | - |
Poznámka. * Množství DNA ve všech vzorcích bylo 50 ng.
Tabulka 5. Detekce kódů Colletotrichum na listech rajčat *
Číslo vzorku | Místo růstu | C. Detekce kódovacích kódů | Prahový cyklus |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarské území, krymský okres | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarské území, okres Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Množství DNA ve všech vzorcích bylo 50 ng.
Náš testovací systém není v citlivosti a specificitě horší než systém vyvinutý britskými vědci (Cullen et al., 2002) a je vhodný pro analýzu vzorků rostlin. Jeho aplikace pro analýzu semenných hlíz umožnila identifikovat DNA C. coccodes v hlízách bez vnějších známek poškození a úspěšně analyzovat infekci listů.
Doposud nebyla v Rusku provedena žádná analýza hlíz bramboru na napadení C. coccodes. Naše první studie ukázala, že ze 16 testovaných hlíz pěstovaných v různých oblastech Ruské federace obsahuje 5 C. coccodes. To ukazuje, že černá skvrna bramborových hlíz je v Rusku běžnou chorobou brambor a její role při snižování objemu a kvality úrody brambor je podceňována.
Analýza listů rajčete odhalila významnou přítomnost DNA C. coccodes v jednom listu z oblasti Yeisk na Krasnodarském území. Dříve byly při zkoumání rajčatových polí v jižním Rusku pomocí britského testovacího systému (Cullen et al., 2002) nalezeny listy obsahující C. coccodes a na některých polích vysoký podíl listů infikovaných C. coccodes (Belov et al., 2018). Na území Krasnodar a Primorsky v Moskevské oblasti jsme našli plody rajčat, ze kterých se nám podařilo izolovat čisté kultury C. coccodes. Je možné, že C. coccodes je na rajčatech v Rusku mnohem rozšířenější, než se nyní předpokládá, a jeho škodlivost je také podceňována.
Dosud tedy bylo nashromážděno dostatek informací o rozšířené distribuci C. coccodes na bramborách a rajčatech.
Pro lepší pochopení úlohy této houby při vývoji chorob brambor a rajčat je nutné sledovat její prevalenci v Rusku, studovat roli infekcí půdy a semen a roli černé skvrny při ztrátách během skladování. Tuto diagnostiku může významně usnadnit použití diagnostiky PCR a současné použití obou testovacích systémů významně zvýší přesnost analýzy.
Tato práce byla podpořena grantem Ruské vědecké nadace č. 18-76-00009.
Článek byl publikován v časopise „Mycology and Phytopathology“ (ročník 54, č. 1, 2020).