JÍST. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Nedávno bylo prokázáno, že houba ascomycete Ilyonectria crassa je schopna infikovat hlízy brambor. Tato práce je první, která analyzuje biologické vlastnosti a odolnost vůči některým fungicidům kmene I. crassa izolovaného z brambor. Sekvence druhově specifických oblastí kmene „brambor“ se shodovaly se sekvencemi získanými dříve pro houby izolované z kořenů narcisu, ženšenu, osiky a buku, cibulovin a listů tulipánu. Zdá se, že mnoho divokých a zahradních rostlin může být rezervami I. crassa. Zkoumaný kmen infikoval rajčata a plátky brambor, ale neinfikoval celé ovoce rajčete a neporušenou bramborovou hlízu. To ukazuje, že I. crassa je raněný parazit. Hodnocení rezistence na fludioxonil, difenokonazol a azoxystrobin na živném médiu ukázalo vysokou účinnost těchto léčiv.
Indikátor EC50 (koncentrace fungicidu, která zpomaluje dvojnásobnou rychlostí radiálního růstu kolonie ve srovnání s kontrolou bez fungicidů) byla rovna 2; 0.4 a 7.4 mg / l. Při fytopatologickém hodnocení hlíz bramboru a vývoji opatření na ochranu rostlin je třeba vzít v úvahu možnost vzniku choroby způsobené I. crassa.
Vývoj fytopatogenních mikroorganismů vede k vysokým ztrátám ve všech fázích pěstování a skladování brambor. Při plánování ochranných opatření se zpravidla berou v úvahu známé patogeny, jako jsou druhy rodů Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora atd. V posledních letech se však objevuje stále více zpráv o výskytu nových fytopatogenních mikroorganismů na bramborách. Jejich biologie je špatně studována, účinnost fungicidů používaných na brambory ve vztahu k nim není známa, diagnostické metody nebyly vyvinuty. Při hromadném vývoji jsou schopné způsobit značné poškození úrody brambor. Jedním z těchto mikroorganismů je houba ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, kterou autoři poprvé objevili na hlízách brambor (Chudinova et al., 2019).
Tato práce představuje výsledky analýzy kmene I. crassa izolovaného z hlíz bramboru. Byla studována morfologie kolonií a myceliálních struktur I. crassa, nukleotidové sekvence druhově specifických oblastí DNA, virulence na brambory a rajčata a rezistence na některé populární fungicidy.
Materiály a metody
Použili jsme kmen I. crassa 18KSuPT2 izolovaný v roce 2018 z postižené hlízy brambor pěstované v oblasti Kostroma. Hlíza byla zasažena suchým hnilobným typem s dutinou pokrytou světle hnědým myceliem. Pomocí sterilní pitevní jehly bylo houbové mycelium přeneseno do Petriho misky s agarovým médiem (pivní mladina 10%, agar 1.5%, penicilin 1000 U / ml). Destičky byly inkubovány ve tmě při 24 ° C.
K fotografování, hodnocení velikosti a morfologie spor a sporových orgánů byl použit světelný mikroskop Leica DM2500 s digitálním fotoaparátem ICC50 HD a binokulární mikroskop Leica M80 s digitálním fotoaparátem IC80HD (Leica Microsystems, Německo).
Pro izolaci DNA bylo mycélium houby pěstováno v kapalném médiu hrachu, poté zmrazeno v kapalném dusíku, homogenizováno, inkubováno v pufru CTAB, purifikováno chloroformem a dvakrát promyto 2% alkoholem.
Metoda extrakce DNA je podrobně popsána v článku Kutuzové a kol. (2017).
Pro stanovení druhu molekulárními metodami a srovnání s jinými známými kmeny I. crassa byla provedena PCR s primery, které umožňovaly amplifikaci druhově specifických oblastí DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (primery ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genové oblasti b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) a faktor prodloužení translace 1α (tef1α) (primery EF1-728F / EF1-986R, Carbone a Kohn, 1999). Amplikony požadované délky byly extrahovány z gelu pomocí soupravy Evrogen CleanUp. Amplifikované oblasti byly sekvenovány pomocí sady BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) na automatizovaném sekvenceru Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Výsledné nukleotidové sekvence byly použity k hledání shody v databázi GenBank amerického Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI). Fylogenetická analýza byla provedena pomocí programu MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
Stanovení virulence bylo provedeno na celých zelených plodech rajčat velkoplodých (odrůda Dubrava) a hlíz bramboru (odrůda Gala). Kromě toho byly k simulaci poškození poškozeného ovoce a hlíz použity plátky stejného ovoce a hlíz. Plátky hlíz byly umístěny do vlhkých komor, kterými byly Petriho misky s mokrým filtračním papírem na dně. Na papír byl položen sklíčko, na které byly následně položeny plátky hlíz nebo ovoce. Celé hlízy a plody byly také umístěny do nádob s mokrým filtračním papírem na dně. Do středu řezu (nebo na neporušený povrch hlízy nebo plodu) byl po 5 dnech pěstování na mladinovém agaru umístěn kousek agaru (5 x 5 mm) s houbovými hyfy.
Hodnocení odolnosti kmenů hub vůči fungicidům bylo provedeno v laboratorních podmínkách na agarovém živném médiu. Studovali jsme citlivost na fungicidní léky Maxim, KS (účinná látka fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Státní katalog ..., 2020). Vyhodnocení bylo provedeno na Petriho miskách na médiu se sladinovým agarem s přídavkem studovaných léčiv v koncentracích účinné látky 0.1; jeden; 1 ppm (mg / l) (pro fludioxonil a difenokonazol), 10; deset; 1 ppm (pro azoxystrobin) a v médiu bez fungicidu (kontrola). Fungicid byl přidán do roztaveného média ochlazeného na 10 ° C, poté bylo médium nalito do Petriho misek. Agarový blok s houbovým myceliem byl umístěn do středu Petriho misky a kultivován při teplotě 100 ° C ve tmě. Po 60 dnech inkubace byly měřeny průměry kolonií ve dvou vzájemně kolmých směrech; výsledky měření pro každou kolonii byly zprůměrovány. Pokusy byly prováděny trojmo. Na základě výsledků analýz byla vypočítána EC24, která se rovná koncentraci fungicidu, což snížilo rychlost radiálního růstu kolonie na polovinu vzhledem k fungicidní kontrole.
Výsledky a diskuse
Na Petriho miskách s mladinovým agarem tvořila houba kolonie s bílým vločkovitým myceliem. Médium pod myceliem se změnilo na červenohnědé. Když médium vyschne, houba vytvořila spory dvou typů na jednoduchých a agregovaných konidioforech v malé sporodochii. Makrokonidie jsou protáhlé, válcovité, s jedním až třemi přepážkami, průměrná délka 27.2 µm s rozsahem hodnot od 23.2 do 32.2 µm, šířka - až 4.9 µm (obr. 1). Průměrná délka mikrokonidií je 14.3 µm s rozsahem hodnot od 10.3 do 18.1 µm, šířka je až 4.0 µm. Všechny makro- a mikromorfologické znaky zapadají do variačního rozmezí druhu Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Sekvence druhově specifických oblastí DNA (ITS, b-tubulin, TEF la) se zcela shodovaly se sekvencemi kmenů I. crassa, které jsme studovali dříve (Chudinova et al., 1, tabulka 2019). Pro studium prevalence I. crassa v jiných oblastech a pro analýzu spektra postižených kultur byly analyzovány analogické sekvence DNA v databázi GenBank (tabulka 1). Překrytí bylo 1 až 86%. Sekvence všech tří oblastí DNA „bramborového“ kmene I. crassa byly identické se sekvencemi kmenů izolovaných z cibule lilie a kořenů narcisu v Nizozemsku a z kořene ženšenu v Kanadě. Nepodařilo se nám najít další kmeny I. crassa se třemi analyzovanými podobnými sekvencemi v otevřených databázích. Analýza uložených sekvencí ITS a b-tubulinu však ukázala přítomnost I. crassa na listech tulipánů ve Velké Británii. Houby s podobnou sekvencí ITS byly identifikovány při analýze mykobioty kořenů osiky v Kanadě a kořenů buku v Itálii, hlíz bramboru v Saúdské Arábii (tabulka 100). Výsledky této studie ukazují, že I. crassa má globální distribuci a je schopen infikovat různé druhy rostlin.
Při stanovení patogenity na plátcích rajčete a brambor 5. dne dosáhl průměr léze 1.5 cm. Zkoumaný kmen neinfikoval celé plody rajčete a neporušené bramborové hlízy. Na rajčatech však byly ovlivněny sepaly. Aby se vyloučila možnost kontaminace z mycelia vyvinutého na plátku hlíz bramboru, byl izolován houbový izolát do čisté kultury. Bylo to úplně totožné s rodičovským kmenem. I. crassa je očividně parazit rány.
Předpěstovací ošetření semenných hlíz fungicidy snižuje růst chorob na rostlinách během vegetačního období. Pro výběr účinných fungicidů je důležité posoudit, které z nich jsou účinné proti I. сrassa. Práce studovala rozšířené účinné látky fungicidů - fludioxonil, azoxystrobin, difenokonazol. Fludioxonil je obsažen v několika směsích používaných k ošetření semen a hlíz před výsadbou. Fludioxonil (Maxim) se také používá k ošetření semenných hlíz před skladováním. Difenokonazol a azoxystrobin jsou také zahrnuty v řadě přípravků používaných ke zpracování semen, stejně jako v přípravcích určených ke zpracování vegetativních rostlin (Státní katalog ..., 2020).
Rychlost růstu I. crassa byla studována na médiu (obr. 2) s různými koncentracemi účinných látek: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) a difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabulka 2). Tyto přípravky lze považovat za vysoce účinné proti I. crassa, protože jejich EC50 je významně nižší než doporučená koncentrace přípravku v pracovní tekutině používané k ošetření hlíz. Podle Státního katalogu ... (2020) je koncentrace fludioxonilu v kapalině pro ošetření hlíz bramboru od 500 do 1000 ppm, azoxystrobin (v kapalině pro ošetření dna brázdy) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (v kapalině pro ošetření vegetativních rostlin) - 187.5– 625 ppm.
Tabulka 1. Podobnost sekvencí druhově specifických sekvencí kmene 18KSuPT2 a kmenů Ilyonectria crassa dostupných v databázi Genbank
Kmen | Hostitelská rostlina, místo vylučování | Pořadová čísla uložená v GenBank, procento podobností | Odkaz | ||
TO JE | β-tubulin | TEF 1a | |||
17KSPT1 a 18KSuPT2 | Bramborová hlíza, oblast Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, tato práce |
CBS 158/31 | Kořeny narcisu, Nizozemsko | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral a kol., 2012 |
CBS 139/30 | Lily bulb, Nizozemsko | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Kořen ženšenu, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulipánový list, Velká Británie | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Nd | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Osiky kořenů, Kanada | MT294410 100 | Nd | Nd | Ramsfield a kol., 2020 |
ER1937 | Buk, Itálie | KR019363 99.65 | Nd | Nd | Tizzani, Haegi, Motta. Přímé podání |
KAUF 19 | Bramborová hlíza, Saúdská Arábie | HE649390 98.3 | Nd | Nd | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = není uloženo
Tabulka 2. Odolnost Ilyonectria crassa vůči fungicidům
(účinná látka) | EC50, ppm | ||||
3 den | 5 den | 7 den | |||
Ovládání | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
V naší práci byly kmeny I. crassa izolovány z hlíz bramboru v regionech Kostroma a Moskva (Chudinova et al., 2019). Vysoký podíl kmenů hub se sekvencemi ITS identickými s I. crassa byl odhalen při analýze mykobioty hlíz bramboru v Saúdské Arábii (Gashgari a Gherbawy, 2013). Zdá se, že I. crassa není na bramborách tak vzácný, jak by se mohlo zdát. Naše experimenty ukázaly, že houba může infikovat poškozené plody rajčat. Z literatury je známo, že I. crassa je schopen se vyvíjet v půdě saprotroficky (Moll et al., 2016) a ovlivňovat celou řadu rostlin, dokonce i taxonomicky vzdálených, jako jsou narcisy, lilie, ženšen, osika a buk (tabulka 1). jeden). Zdá se, že mnoho divokých a zahradních rostlin může být rezervami I. crassa. Výše uvedené ukazuje, že při vývoji ochranných opatření je nutné vzít v úvahu možnost ovlivnění hlíz bramboru touto houbou. Rozšířené přípravky na ošetření hlíz bramboru obsahující fludioxonil, azoxystrobin a difenokonazol prokázaly vysokou fungicidní účinnost proti I. crassa.
Tuto práci podpořila Ruská nadace pro základní výzkum (grant č. 20-016-00139).
Článek byl publikován v časopise „Plant Protection Bulletin“, 2020, 103 (3)