S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
úvod
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, původce pozdní plíseň, ekonomicky nejdůležitější choroby brambor a rajčat, přitahuje pozornost vědců z různých zemí po více než století a půl. Náhle se v Evropě objevil v polovině XNUMX. století a způsobil bramborovou epidemii, která zůstala v paměti mnoha generací.
Doposud se jí často říká „houba irského hladu“. Téměř sto let po prvních epidemiích byly objeveny divoké mexické druhy brambor rezistentní vůči plísni, byly vyvinuty způsoby jejich křížení s pěstovanými bramborami (Muller, 1935) a byly získány první odrůdy odolné proti plísni (Pushkarev, 1937). Brzy po zahájení jejich komerční kultivace se však nahromadily rasy patogenu pozdní plísně, které byly virulentní vůči rezistentním odrůdám. a zavedení nových genů rezistence z divokých mexických brambor do odrůd začalo rychle ztrácet účinnost.
Neúspěchy při použití monogenního (vertikálního) odporu přinutily chovatele hledat složitější způsoby využití nespecifické polygenní (horizontální) rezistence. V posledních letech se v jednotlivých populacích parazita začaly hromadit vysoce agresivní rasy, které způsobovaly erozi dokonce nespecifického odporu. Nástup kmenů rezistentních vůči fungicidům způsobil problémy při používání chemikálií na ochranu brambor.
Vzhledem k významným rozdílům mezi oomycetami a houbami v chemickém složení, ultrastruktuře a metabolismu jsou fungicidy, zejména systemické, používané k ochraně rostlin před mnoha houbovými chorobami, proti oomycetám neúčinné.
Proto se při chemické ochraně proti plísni používalo několikanásobné (až 12krát za sezónu nebo více) postřik kontaktními látkami širokého spektra účinku. Revolučním krokem bylo použití fenylamidů, které jsou toxické pro oomycety a šíří se systémově v rostlinách. Jejich široké použití však rychle vedlo k akumulaci rezistentních kmenů v populacích hub (Davidse et al., 1981), což významně komplikovalo ochranu rostlin. P. infestans je prakticky jediným parazitem mírného pásma, jehož poškození v ekologickém zemědělství nelze neutralizovat bez použití chemických prostředků ochrany (Van Bruggen, 1995).
Výše uvedené vysvětluje obrovskou pozornost, kterou vědci z různých zemí věnují studiu populací P. infestans, dynamice jejich hojnosti a genetického složení, jakož i genetickým mechanismům variability.
Životní cyklus R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans vyvíjí mezibuněčné mycelium s haustoria uvnitř bramborových listů. Při krmení listovými tkáněmi způsobuje tvorbu tmavých skvrn, které ve vlhkém počasí zčernají a hnijí. Se silnou porážkou zemře celý list. Po určité době krmení se na myceliu tvoří výrůstky - sporangiofory - které rostou ven přes průduchy. Za vlhkého počasí tvoří bílý květ kolem skvrn na spodní straně listů. Na koncích sporangioforů se tvoří zoosporangie ve tvaru citronu, které se odlamují a jsou unášeny dešťovou sprškou (obr. 1). Při pádu do kapek vody na povrchu bramborového listu klíčí sporangie s 6-8 zoospórami, které jsou po určité době pohybu zaoblené, pokryté skořápkou a vyklíčí klíčkem. Klíček proniká průduchy do tkáně listu. Za určitých podmínek může sporangie růst v růstové trubici přímo do listové tkáně. Za příznivých podmínek je doba od infekce do vzniku nové sporulace pouze 3-4 dny.
Jakmile jsou sporangie na zemi a filtrovány přes půdu, jsou schopné infikovat hlízy. Silně postižené hlízy během skladování hnijí; u slabě postižených může infekce přetrvávat až do příští sezóny. Kromě toho může původce pozdní plíseň přetrvávat v zimě ve formě oospór (silnostěnné klidové sexuální výtrusy) v půdě na rostlinných zbytcích a na semenech rajčat. Oospory se tvoří na živých orgánech rostlin, když se kmeny různých typů páření setkávají s nadměrnou vlhkostí. Na jaře se na vysazených infikovaných hlízách a na rostlinných zbytcích s oospórami vytváří nepohlavní sporulace; zoospory vstupují do půdy a způsobují infekci spodních listů rostlin. V některých případech může mycelium růst z infikované hlízy do zelené části rostliny a obvykle se objevuje v horní části stonku.
Významný rozdíl mezi oomycety a většinou hub spočívá v převaze diplofázy v jejich životním cyklu s gametickou meiózou a klíčením zygotů (oospór) bez redukčního štěpení jader. Zdá se, že tato vlastnost, plus dipolární heterotallismus nahrazující bisexualitu, umožňuje aplikovat na oomycety přístupy vyvinuté pro studium populací vyšších eukaryot (analýza panmixie a dělení populací, intra- a interpopulační genové toky atd.). Tři faktory však neumožňují úplné přenesení těchto přístupů ke studiu populací P. infestans.
1. Spolu s hybridními oospory se v populacích vytvářejí samoplodné a partenogenetické oospory (Fife a Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) a frekvence jejich tvorby může být dostatečná k ovlivnění na výsledcích zkoušky.
2. Pohlavní proces u P. infestans nevýznamně přispívá k dynamice velikosti populace, protože houba se množí hlavně vegetativními spórami a tvoří více než 90% výsledků analýzy páření tradičním způsobem na živném médiu ... vegetačním obdobím je několik generací nepohlavní sporulace (vývoj polycyklických chorob). Oospory hrají důležitou roli při ochraně organismu v období, kdy zde nejsou zelené rostliny (v zimě), a při primární infekci sazenic. Pak během léta dochází k klonální reprodukci a ke zvýšení nebo naopak snížení počtu jednotlivých klonů, které vznikají v důsledku sexuální rekombinace, což je určováno hlavně výběrem přizpůsobenějších. Poměr jednotlivých klonů v populaci na začátku a na konci epifytotiky proto může být zcela odlišný.
3. Popsaný cyklus je charakteristický pro původní populace P. infestans v jejich domovině, Střední Americe. V jiných oblastech světa nebyl pohlavní proces znám již více než 100 let; vegetativní mycelium v infikovaných hlízách brambor bylo stadiem zimování. Životní cyklus byl zcela agamický a šíření bylo ohniskové povahy: infekce z jednotlivých infikovaných zasazených hlíz přešla na listy a vytvořila primární ohniska nemoci, která se mohla během masivního vývoje nemoci spojit.
V některých oblastech tedy může docházet ke střídání sexuálních a nepohlavních cyklů, zatímco v jiných - pouze k nepohlavnímu cyklu.
Původ P. INFESTANS
P. infestans se v Evropě objevil na konci první poloviny 1991. století. Vzhledem k tomu, že brambor pochází z severovýchodní Jižní Ameriky, předpokládalo se, že parazit byl odtud přivezen do Evropy během rozmachu chilského ledku. Studie provedené na bramborové stanici Rockefeller Center v údolí Toluca v Mexiku však vynutily revizi tohoto pohledu (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. V údolí Toluca mají místní hlízovité druhy brambor (Solanum demissum, S. bulbocastanum atd.) Různé sady genů pro vertikální rezistenci v kombinaci s vysokou úrovní nespecifické rezistence, což naznačuje dlouhý společný vývoj s parazitem. Jihoamerické druhy, včetně pěstovaných brambor, postrádají geny rezistence.
2. V údolí Toluca se vyskytují izoláty s pářícími se typy A1 a A2, v důsledku čehož je rozšířená interbrední populace P. infestans; zatímco ve vlasti pěstovaných brambor v Jižní Americe se parazit šíří klonálně.
3. V údolí Toluca se každoročně vyskytují závažné epidemie plísně pozdní. Proto je mezi severoamerickými vědci (Cornell University) stanoven názor na Střední Ameriku (Střední Ameriku) jako na místo, kde se rodí bramborová phytophthora (Goodwin et al., 1994).
Jihoameričtí vědci tento názor nesdílejí. Věří, že pěstovaný brambor a jeho parazit P. infestans mají společnou domovinu - jihoamerické Andy. Svůj názor podpořili molekulárními studiemi o analýze polymorfismů DNA mitochondriálního genomu (mtDNA) a jaderných genů RAS a β-tubulinu (Gomez-Alpizar et al., 2007). Ukázali, že kmeny shromážděné z různých částí světa pocházejí ze tří odlišných rodových linií, které (všechny tři) se nacházejí v jihoamerických Andách. Andské haplotypy jsou potomky dvou linií: izoláty nejstarší linie mtDNA se nacházejí na divokých Solanaceae ze sekce Anarrhicomenum v Ekvádoru, zatímco izoláty druhé linie jsou běžné na bramborách, rajčatech a divokých nočních rostlinách. V Toluce dokonce vzácné haplotypy pocházejí pouze z jedné linie, přičemž genetická variabilita kmenů Toluca (nízká alelická frekvence některých variabilních míst) naznačuje silný vliv zakladatele v důsledku nedávného driftu.
Kromě toho byl v Andách nalezen nový druh P. andina, morfologicky a geneticky podobný P. infestans, který podle autorů poukazuje na Andy jako horké místo speciace v rodu Phytophthora. A konečně v Evropě a Spojených státech zahrnuje populace P. Infestans obě andské linie, zatímco v Toluce pouze jednu.
Tato publikace podnítila reakci skupiny vědců z různých zemí, kteří provedli mnoho experimentálních prací za účelem revize předchozí studie (Goss et al., 2014). V této práci byly za prvé ke studiu polymorfismů DNA použity informativnější sekvence mikrosatelitních DNA; zadruhé, pro analýzu shlukování, migračních cest, časové divergence populací atd. byly použity pokročilejší modely (F-statistika, Bayesovské aproximace atd.) a za třetí bylo použito srovnání nejen s andským druhem P. andina, u kterého byla stanovena hybridní povaha (P. infestans x Phytophthora sp.) , ale také s mexickými endemickými druhy P. mirabilis, P. Ipomoeae a Phytophthora phaseoli - geneticky blízcí P. infestans patřící do stejné clade (Kroon et al., 2012). Na základě těchto analýz bylo jednoznačně prokázáno, že kořenová část fylogenetického stromu všech druhů rodu Phytophthora, která byla do studie přijata, s výjimkou hybridu P. andina, patří k mexickým kmenům a migrační tok má směr Mexiko - Andy, a ne naopak, a jeho začátek se shoduje s evropským kolonizace Nového světa (před 300-600 lety). K výskytu druhu P. infestans, specializovaného na porážku brambor, došlo v sekundárním genetickém centru vzniku hlízovitých nočních stínů, tj. ve Střední Americe.
Genom P. INFESTANS
V roce 2009 sekvenoval mezinárodní tým vědců kompletní genom P infestans (Haas et al, 2009), jehož velikost byla 240 MB. To je několikrát více než u blízce příbuzných druhů P. sojae (95 Mb), které způsobují hnilobu kořenů sóji, a P. Ramorum (65 Mb), které ovlivňují takové cenné druhy stromů, jako je dub, buk a některé další. Získaná data ukázala, že genom obsahuje velké množství kopií opakovaných sekvencí - 74%. Genom obsahuje 17797 genů kódujících proteiny, z nichž většinu tvoří geny zapojené do buněčných procesů, včetně replikace DNA, transkripce a translace proteinů.
Srovnání genomů rodu Phytophthora odhalilo neobvyklou organizaci genomu, skládající se z bloků sekvencí konzervovaných genů, ve kterých je hustota genů relativně vysoká a obsah opakovaných sekvencí je relativně nízký, a jednotlivých oblastí s nekonzervovanými sekvencemi genů, s nízkou hustotou genů a vysokým obsahem opakujících se oblastí. Konzervativní bloky tvoří 70% (12440) všech genů kódujících proteiny P. infestans. V konzervativních blocích jsou geny obvykle těsně rozmístěny s průměrnou intergenickou vzdáleností 604 bp. V oblastech mezi konzervativními bloky je intergenická vzdálenost větší (3700 bp) v důsledku zvýšení hustoty opakujících se prvků. Rychle se rozvíjející efektorové sekreční geny jsou lokalizovány v genově chudých oblastech.
Sekvenční analýza genomu P. Infestans ukázala, že přibližně jedna třetina genomu patří k transponovatelným prvkům. Genom P. infestans obsahuje podstatně více různých rodin transpozonů než jiné známé genomy. Většina transpozonů P. infestans patří do cikánské rodiny.
V genomu P. infestans bylo identifikováno velké množství specifických genových rodin zapojených do patogeneze. Významná část z nich kóduje efektorové proteiny, které mění fyziologii hostitelské rostliny a přispívají k její infekci. Spadají do dvou širokých kategorií: apoplastické efektory, které působí v mezibuněčných prostorech (apoplasty), a cytoplazmatické efektory, které vstupují do buněk prostřednictvím haustoria. Apoplastické efektory zahrnují vylučované hydrolytické enzymy, jako jsou proteázy, lipázy a glykosylázy, které ničí rostlinné buňky; inhibitory obranných enzymů hostitelských rostlin a nekrotizující toxiny, jako jsou proteiny podobné Nep1 (NPL) a malé proteiny bohaté na cystein (SCR) podobné Pcf.
Efektorové geny P. infestans jsou četné a obvykle větší než nepatogenní geny. Nejznámější jsou cytoplazmatické efektory RXLR a Crinkler (CNR). Typickými cytoplazmatickými efektory oomycet jsou proteiny RXLR. Všechny dosud objevené efektorové geny RXLR obsahují amino-koncovou skupinu Arg-XLeu-Arg, kde X je aminokyselina. Výsledkem studie bylo zjištění, že v genomu P. infestans existuje 563 genů RXLR, což je o 60% více než v P. sojae a P. ramorum. Přibližně polovina genů RXLR v genomu P. infestans je druhově specifická. Efektory RXLR mají širokou škálu sekvencí. Mezi nimi byla identifikována jedna velká a 150 malých rodin. Na rozdíl od hlavního proteomu jsou efektorové geny RXLR obvykle lokalizovány v genově chudých a na opakování bohatých oblastech genomu. Mobilní prvky, které určují dynamiku těchto oblastí, usnadňují rekombinaci v těchto genech.
Cytoplazmatické CRN efektory byly původně identifikovány v transkriptech P. infestans kódujících peptidy nekrózy rostlinné tkáně. Od jejich objevu se o rodině těchto efektorů vědělo jen málo. Analýza genomu P. Infestans odhalila obrovskou rodinu 196 genů CRN, která je významně větší než u P. sojae (100 CRN) a P. ramorum (19 CRN). Stejně jako RXLR jsou CRN modulární proteiny a skládají se z vysoce konzervované N-koncové domény LFLAK (50 aminokyselin) a sousední domény DWL obsahující různé geny. Většina CRN (60%) obsahuje signální peptid.
Byla studována možnost různých CRN narušit buněčné procesy hostitelské rostliny. Při analýze nekrózy rostlin umožnilo odstranění proteinů CRN2 identifikovat C-koncovou oblast skládající se z 234 aminokyselin (pozice 173-407, doména DXG) a způsobujících buněčnou smrt. Analýza genů CRN P. infestans odhalila čtyři různé C-koncové oblasti, které také způsobují buněčnou smrt v rostlině. Patří mezi ně nově identifikované domény DC (P. Infestans má 18 genů a 49 pseudogenů), stejně jako domény D2 (14 a 43) a DBF (2 a 1), které jsou podobné proteinovým kinázám. Proteiny CRN domén exprimovaných v rostlině jsou konzervovány (v nepřítomnosti signálních peptidů) v rostlinné buňce a stimulují buněčnou smrt intracelulárním mechanismem. Dalších 255 sekvencí obsahujících domény CRN s největší pravděpodobností nefunguje jako geny.
Zvýšení počtu a velikosti rodin efektorových genů RXLR a CRN bylo pravděpodobně způsobeno nealelickou homologní rekombinací a duplikací genů. Navzdory skutečnosti, že genom obsahuje velké množství aktivních mobilních prvků, stále neexistují žádné přímé důkazy o přenosu efektorových genů.
Metody používané při studiu struktury populace
Studium genetické struktury populací je v současné době založeno na analýze čistých kultur kmenů, z nichž se skládají. Analýza populací bez izolace čistých plodin se provádí také pro specifické účely, jako je například studium agresivity populace nebo přítomnost kmenů rezistentních vůči fungicidům v ní (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Tento typ výzkumu zahrnuje použití speciálních metod, jejichž popis je nad rámec tohoto přehledu. Pro srovnávací analýzu kmenů se používá řada metod založených jak na analýze struktury DNA, tak na studiu fenotypových projevů. Srovnávací analýza populací se musí vypořádat s velkým počtem izolátů, což klade určité požadavky na použité metody. V ideálním případě by měly splňovat následující požadavky (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- být levný, snadno implementovatelný, nevyžaduje značné časové náklady, musí být založen na obecně dostupných technologiích (například PCR);
- musí generovat dostatečně velký počet nezávislých znaků kodominantní značky;
- mají vysokou reprodukovatelnost;
- použít minimální množství vyšetřované tkáně;
- být specifické pro substrát (kontaminace přítomná v kultuře by neměla ovlivnit výsledky);
- nevyžadují použití nebezpečných postupů a vysoce toxických chemikálií.
Bohužel neexistují žádné metody odpovídající všem výše uvedeným parametrům. Pro srovnávací studii kmenů v naší době se používají metody založené na analýze fenotypových vlastností: virulence k odrůdám brambor a rajčat (bramborové a rajčatové rasy), druh páření, spektra izoenzymů peptidázy a glukóza-6-fosfát-izomerázy a analýza struktury DNA: polymorfismus délky restrikční fragment (RFLP), který je obvykle doplněn hybridizační sondou RG 57, analýza mikrosatelitních repetící (SSR a InterSSR), amplifikace náhodnými primery (RAPD), amplifikace restrikčních fragmentů (AFLP), amplifikace primery homologními se sekvencemi mobilních prvků (například Inter SINE PCR), stanovení haplotypů mitochondriální DNA.
Stručný popis metod pro srovnávací studium kmenů použitých při práci s P. Infestans
Fenotypové znaky
„Bramborové“ závody
„Bramborové“ rasy jsou běžně zkoumaným a používaným ukazatelem. „Jednoduché bramborové“ rasy mají jeden gen pro virulenci brambor, „komplexní“ - nejméně dva. Black et al. (1953) shrnující všechna data, která mají k dispozici, zjistili, že rasa phytophthora je schopna infikovat rostliny genem / geny rezistence odpovídajícími genu / genům virulence P. infestans a našla rasy 1, 2, 3 a 4, které infikují rostliny s geny R1, R2, R3 a R4, tj. interakce mezi parazitem a hostitelem probíhá podle principu gen pro gen. Dále Black za účasti Galleglyho a Malcolmsona objevil geny rezistence R5, R6, R7, R8, R9, R10 a R11 a také odpovídající rasy (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Existuje mnoho údajů o rasovém složení patogenu z různých oblastí. Aniž bychom podrobně analyzovali tato data, uvedeme pouze obecný trend: tam, kde byly použity odrůdy s novými geny rezistence nebo jejich kombinacemi, došlo nejprve k oslabení pozdní plísně, ale poté se objevily a byly vybrány rasy s odpovídajícími virulentní geny a obnovena ohniska pozdní plísně. Specifická virulence proti prvním 4 genům rezistence (R1-R4) byla vzácně pozorována ve sbírkách shromážděných před zavedením odrůd s těmito geny do kultivace, ale počet virulentních kmenů prudce vzrostl, když patogen parazitoval na odrůdách nesoucích tyto geny. Geny 5-11 byly naopak ve sbírkách zcela běžné (Shaw, 1991).
Studie poměru různých ras během vegetačního období, provedená na konci 1980. let, ukázala, že na počátku vývoje onemocnění převládají v populaci klony s nízkou agresivitou a 1-2 virulentní geny.
S rozvojem pozdní plíseň dále klesá koncentrace původních klonů a zvyšuje se počet „komplexních“ ras s vysokou agresivitou. Jejich výskyt na konci sezóny dosahuje 100%. Při skladování hlíz dochází ke snížení agresivity a ke ztrátě jednotlivých genů virulence. Dynamika nahrazování klonů může nastat u různých odrůd různými způsoby (Rybakova & Dyakov, 1990). Naše studie v letech 2000–2010 však ukázaly, že mezi kmeny izolovanými jak z brambor, tak z rajčat se od samého počátku epifytotiky vyskytují složité rasy. To je pravděpodobně způsobeno změnami v populacích P. Infestans v Rusku.
V letech 1988–1995 dosáhla frekvence výskytu „superraces“ se všemi nebo téměř všemi geny virulence v různých oblastech 70–100%. Taková situace byla zaznamenána například v Bělorusku, v regionech Leningrad, Moskva, v Severním Osetsku a v Německu (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomato" závody
U kultivarů rajčat byly nalezeny pouze 2 geny rezistence na pozdní plíseň - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) a Ph2 (Al-Kherb, 1988). Stejně jako v případě bramborových ras dochází k interakci mezi rajčaty a P. infestans na základě genů. Rasa T0 infikuje odrůdy, které nemají geny rezistence (většina průmyslově používaných odrůd), rasa T1 infikuje odrůdy genem Ph1 (Ottawa) a rasa T2 infikuje odrůdy genem Ph2.
V Rusku byl téměř výhradně T0 nalezen na bramborách; Na začátku sezóny na rajčatech převládala T0, později ji však nahradila rasa T1 (Dyakov a kol., 1975, 1994). Po roce 2000 se T1 na bramborách v mnoha populacích začal objevovat na samém počátku epifytotiky. Ve Spojených státech byly bramborové kmeny pro rajčata nepatogenní, stejně jako rasy T0, T1 a T2, zatímco T1 a T2 převládaly na rajčatech (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Typ páření
Pro provedení studie jsou nutné testovací (referenční) kmeny se známými typy páření - A1 a A2. Zkušební izolát se jim naočkuje ve dvojicích do Petriho misek s ovesným agarovým médiem. Po inkubaci po dobu 10 dnů se destičky zkoumají na přítomnost nebo nepřítomnost oospór v médiu v kontaktní zóně kmenů. Existují 4 možnosti: kmen patří k typu páření A1, pokud vytváří oospory s testerem A2, do A2, pokud tvoří oospory s testerem A1, do A1A2, pokud tvoří oospory s oběma testery, nebo je sterilní (00), pokud netvoří oospory bez testeru (poslední dvě skupiny jsou vzácné).
Aby bylo možné rychleji určit typy páření, byly provedeny pokusy identifikovat oblasti genomu spojené s typem páření s cílem jejich dalšího použití k určení typu páření pomocí PCR. Jeden z prvních úspěšných experimentů k identifikaci takového místa byl proveden americkými vědci (Judelson et al., 1995). Pomocí metody RAPD byli schopni identifikovat oblast W16 spojenou s typem páření u potomků dvou zkřížených izolátů a navrhnout pár 24-bp primerů pro její amplifikaci (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') a W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Po restrikci produktu PCR restrikčním enzymem HaeIII bylo možné oddělit izoláty párováním typů A1 a A2.
Další pokus o získání markerů PCR k určení typů páření byl proveden korejskými vědci (Kim, Lee, 2002). Identifikovali konkrétní produkty pomocí metody AFLP. Ve výsledku byl vyvinut pár primerů PHYB-1 (vpřed) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') a PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTT-3'), což umožňuje selektivní amplifikaci genomové oblasti spojené s typem páření A2. Následně pokračovali v této práci a navrhli primery 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, vpřed) a 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), což umožnilo selektivní amplifikaci oblasti Mat-A1, charakteristickou pro kmeny s typem páření A1. Použití PCR diagnostiky typů páření ukázalo dobré výsledky při studiu populací P. infestans v České republice (Mazakova et al., 2006), Tunisku (Jmour, Hamada, 2006) a dalších regionech. V naší laboratoři (Mytsa, Elansky, nepublikováno) bylo analyzováno 34 kmenů P. infestans izolovaných z nemocných bramborových a rajčatových orgánů v různých oblastech Ruska (regiony Kostroma, Ryazan, Astrachan a Moskva). Výsledky PCR analýzy za použití specifických primerů se více než 90% shodovaly s výsledky analýzy typu páření tradiční metodou na živném médiu.
Tabulka 1. Variabilita rezistence v klonu Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Místo odběru vzorků | Počet analyzovaných izolátů | Počet citlivých (S), slabě rezistentních (SR) a rezistentních (R) kmenů, ks (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekatěrinburg město | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sachalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omskská oblast | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylová rezistence jako marker populace
Na začátku 1980. let byla v různých oblastech zaznamenána silná ohniska pozdní plíseň způsobená kmeny P. infestans rezistentními na metalaxyl. Bramborové farmy v mnoha zemích utrpěly značné ztráty (Dowley a O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Od té doby bylo v mnoha zemích světa prováděno neustálé sledování výskytu kmenů rezistentních na fenylamid v populacích P. infestans. Kromě praktického hodnocení vyhlídek na použití léčivých přípravků obsahujících fenylamid, budování systému ochranných opatření a předpovídání epifytotií se rezistence na tyto léky stala jedním z charakteristických znaků široce používaných pro srovnávací analýzu populací tohoto patogenu. Použití rezistence na metalaxyl ve srovnávacích populačních studiích by však mělo být provedeno s přihlédnutím ke skutečnosti, že: 1 - genetický základ rezistence dosud nebyl přesně stanoven, 2 - rezistence na metalaxyl je selektivně závislý znak, který se může měnit v závislosti na použití fenylamidů, 3 - odlišný stupeň citlivosti na metalaxylové kmeny v rámci jedné klonální linie (tabulka 1).
Spektra isozymů
Markery izozymu jsou obvykle nezávislé na vnějších podmínkách, vykazují Mendelovu dědičnost a jsou kodominantní, což umožňuje rozlišovat mezi homo- a heterozygoty. Použití proteinů jako genových markerů umožňuje identifikovat jak velké reorganizace genetického materiálu, včetně chromozomálních a genomových mutací, tak substituce jednotlivých aminokyselin.
Elektroforetické studie proteinů ukázaly, že většina enzymů existuje v organismech ve formě několika frakcí lišících se elektroforetickou mobilitou. Tyto frakce jsou výsledkem kódování více forem enzymů různými lokusy (isozymy nebo isozymy) nebo různými alelami stejného lokusu (alozymy nebo aloenzymy). To znamená, že isozymy jsou různé formy jednoho enzymu. Různé formy mají stejnou katalytickou aktivitu, ale mírně se liší v substitucích jednotlivých aminokyselin v peptidu a v náboji. Tyto rozdíly jsou odhaleny během elektroforézy.
Při studiu kmenů P. infestans se používají spektra izoenzymů dvou proteinů, peptidázy a glukóza-6-fosfát izomerázy (tento enzym je v ruských populacích monomorfní; metody jeho studia proto nejsou v této práci uvedeny). K jejich oddělení na isozymy v elektrickém poli se na gelovou desku umístěnou v elektrickém poli aplikují proteinové přípravky izolované ze studovaných organismů. Rychlost difúze jednotlivých proteinů v gelu závisí na náboji a molekulové hmotnosti; proto se v elektrickém poli směs proteinů rozdělí na jednotlivé frakce, které lze vizualizovat pomocí speciálních barviv.
Studium peptidázových izoenzymů se provádí na gelech celulóza-acetát, škrob nebo polyakrylamid. Nejpohodlnější je metoda založená na použití gelů z acetátu celulózy vyráběných společností Helena Laboratories Inc. Nevyžaduje velké množství testovaných materiálů, umožňuje získat kontrastní pruhy na gelu po elektroforéze pro oba enzymové lokusy, jeho implementace nevyžaduje velké časové a materiálové náklady (obr. 2).
Malý kousek mycelia se přenese do 1,5 ml mikrozkumavky a přidají se k ní 1–2 kapky destilované vody. Poté se vzorek homogenizuje (například elektrickou vrtačkou s plastovým nástavcem vhodným pro mikrozkumavku) a sedimentuje po dobu 25 sekund na odstředivce při 13000 8 otáčkách za minutu. XNUMX μl z každé mikrozkumavky. supernatant se přenese na desku aplikátoru.
Gel z acetátu celulózy se vyjme z nádoby s pufrem, vysaje se mezi dva listy filtračního papíru a umístí se pracovní vrstvou na plastovou základnu aplikátoru. Roztok z destičky se přenese aplikátorem na gel 2-4krát. Gel se přenese do elektroforetické komory,
Tabulka 2. Složení roztoku použitého pro barvení gelu acetátu celulózy při analýze izoenzymů peptidázy, kapka barvy (bromfenolová modrá) je umístěna na okraj gelu.
TRIS HCI, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidáza, 1000 5 U / ml XNUMX kapek
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 kapek
MgCl2, 20 mg / ml 2 kapky
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kapek
Oxidáza L-aminokyselin, 20 u / ml 2 kapky
Elektroforéza se provádí po dobu 20 minut. při 200 V. Po elektroforéze se gel přenese na lakovací stůl a natře se speciálním barevným roztokem (tabulka 2). 10 ml 1,6% DIFCO agaru se předběžně roztaví v mikrovlnné troubě, ochladí se na 60 ° C, načež se 2 ml agaru smísí se směsí barev a nalije se na gel. Pruhy se objeví během 15-20 minut. Činidlo oxidázy L-aminokyseliny se přidá těsně před smícháním roztoku s roztaveným agarem.
V ruských populacích je lokus Pep 1 reprezentován genotypy 100/100 a 92/100. Homozygot 92/92 je extrémně vzácný (asi 0,1%). Locus Rehr 2 je reprezentován třemi genotypy 100/100, 100/112 a 112/112 a všechny 3 varianty jsou zcela běžné (Elanky a Smirnov, 2003, obr. 2).
Výzkum genomu
Polymorfismus délky restrikčních fragmentů s následnou hybridizací (RFLP-RG 57)
Celková DNA se zpracuje restrikčním enzymem Eco R1, fragmenty DNA se oddělí elektroforézou v agarózovém gelu. Jaderná DNA je velmi velká a má mnoho opakujících se sekvencí; proto je obtížné přímo analyzovat četné fragmenty získané působením restrikčních enzymů. Proto se fragmenty DNA oddělené v gelu přenesou na speciální membránu a použijí se k hybridizaci se sondou RG 57, která zahrnuje nukleotidy značené radioaktivními nebo fluorescenčními značkami. Tato sonda hybridizuje s opakujícími se genomovými sekvencemi (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Po vizualizaci výsledků hybridizace na světelném nebo radioaktivním materiálu se získá hybridizační profil více lokusů (fingerprinting), představovaný 25-29 fragmenty (Forbes et al., 1998). Nepohlavní (klonální) potomci budou mít stejné profily. Uspořádáním pásů na elektroforetogramu se posuzují podobnosti a rozdíly srovnávaných organismů.
Mitochondriální DNA haplotypy
Ve většině eukaryotických buněk je mtDNA prezentována ve formě dvouvláknové kruhové molekuly DNA, která se na rozdíl od jaderných chromozomů eukaryotických buněk semi-konzervativně replikuje a není spojena s proteinovými molekulami.
Byl sekvenován mitochondriální genom P. infestans a řada prací byla věnována analýze délek restrikčních fragmentů (Carter a kol., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Poté, co Griffith a Shaw (1998) vyvinuli jednoduchou a rychlou metodu pro stanovení mtDNA haplotypů, stal se tento marker jedním z nejpopulárnějších ve studiích P. Infestans. Podstata metody spočívá v postupné amplifikaci dvou fragmentů mitochondriální DNA (ze společného genomu) pomocí primerů F2-R2 a F4-R4 (tabulka 3) a jejich následná restrikce restrikčními enzymy MspI (1. fragment) a EcoR1 (2. fragment). Metoda umožňuje identifikovat 4 haplotypy: Ia, IIa, Ib, IIb. Typ II se liší od typu I přítomností vložky o velikosti 1881 bp a odlišným umístěním restrikčních míst v oblastech P2 a P4 (obr. 3).
Od roku 1996 byly mezi kmeny shromážděnými na území Ruska zaznamenány pouze haplotypy Ia a IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Mohou být identifikovány po oddělení restrikčních produktů pomocí primeru F2-R2 v elektrickém poli (obr. 4, 5). Typy mtDNA se používají při srovnávací analýze kmenů a populací. V řadě prací byly k izolaci klonálních linií a pasportizaci izolátů P. infestans použity typy mitochondriální DNA (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Použitím metody PCR-RFLP se dospělo k závěru, že mtDNA je heterogenní u stejného kmene P. infestans (Elansky a Milyutina, 2007). Podmínky zesílení: 1x (500 s. 94 ° C), 40x (30 s. 90 ° C, 30 s. 52 ° C, 90 s. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakční směs: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polymeráza, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq pufr, 0,2 mM každý dNTP, 30 pM primer a 5 ng analyzované DNA, deionizovaná voda - až 20 μl.
Omezení produktu PCR se provádí po dobu 4 až 6 hodin při teplotě 37 ° C. Restrikční směs (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikční pufr (2 μl), deionizovaná voda (6 μl), produkt PCR (10 μl).
Tabulka 3. Primery použité pro amplifikaci polymorfních oblastí mtDNA
Místo | Základní nátěr | Délka a umístění primeru | Délka produktu PCR | Omezit |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Náhodná amplifikace primeru (RAPD)
Při provádění RAPD se používá jeden primer (někdy několik primerů současně) s libovolnou nukleotidovou sekvencí, obvykle o délce 10 nukleotidů, s vysokým obsahem (od 50%) GC nukleotidů a nízkou teplotou žíhání (asi 35 ° C). Takové primery „přistávají“ na mnoha komplementárních místech v genomu. Po amplifikaci se získá velké množství amplikonů. Jejich počet závisí na použitém primeru (primerech) a podmínkách reakce (koncentrace MgCl2 a teplota žíhání).
Vizualizace amplikonů se provádí destilací v polyakrylamidovém nebo agarózovém gelu. Při provádění RAPD analýzy je nutné pečlivě sledovat čistotu analyzovaného materiálu, protože kontaminace jinými živými objekty může způsobit významné zvýšení počtu artefaktů, které jsou poměrně četné i při analýze čistého materiálu (Perez et al, 1998). Použití této metody při studiu genomu P. infestans se odráží v mnoha pracích (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Výběr reakčních podmínek a primerů (bylo studováno 51 10-nukleotidových primerů) je uveden v článku Abu-El Samen et al., (2003).
Mikrosatelitní opakovací analýza (SSR)
Mikrosatelitní repetice (opakování jednoduchých sekvencí, SSR) jsou tandemově opakované krátké sekvence 1-3 (někdy až 6) nukleotidů přítomných v jaderných genomech všech eukaryot. Počet po sobě jdoucích opakování se může pohybovat od 10 do 100. Mikrosatelitní lokusy se vyskytují s poměrně vysokou frekvencí a jsou víceméně rovnoměrně rozloženy po celém genomu (Lagercrantz et al., 1993). Polymorfismus mikrosatelitních sekvencí je spojen s rozdíly v počtu opakování základního motivu. Mikrosatelitní markery jsou kodominantní, což umožňuje jejich použití k analýze struktury populace, určení příbuznosti, tras migrace genotypů atd. Mezi další výhody těchto markerů je třeba poznamenat jejich vysoký polymorfismus, dobrou reprodukovatelnost, neutralitu a schopnost provádět automatickou analýzu a vyhodnocení. Analýza polymorfismu mikrosatelitních opakování se provádí pomocí PCR amplifikace pomocí primerů komplementárních k jedinečným sekvencím sousedícím s mikrosatelitovými lokusy. Zpočátku byla analýza provedena s oddělováním reakčních produktů na polyakrylamidovém gelu. Později zaměstnanci Applied Biosystems navrhli použít fluorescenčně značené primery s detekcí reakčních produktů pomocí automatického laserového detektoru (Diehl et al., 1990) a poté standardních automatických sekvencerů DNA (Ziegle et al., 1992). Označení primerů různými fluorescenčními barvivy umožňuje analyzovat několik markerů najednou na jednom pruhu a podle toho významně zvýšit produktivitu metody a zvýšit přesnost analýzy.
První publikace věnované použití analýzy SSR pro studium P. infestans se objevily počátkem roku 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Ne všechny markery navržené autory vykazovaly dostatečnou míru polymorfismu, nicméně dva z nich (4B a G11) byly zahrnuty do souboru 12 markerů SSR navržených Leesem a kol. (2006) a následně přijaty výzkumnou sítí Eucablight (www.eucablight .org) jako standard pro P. infestans. O několik let později byla zveřejněna studie o vytvoření systému pro multiplexní analýzu DNA P. infestans na základě osmi markerů SSR (Li et al., 2010). A konečně, po vyhodnocení všech dříve navržených markerů a výběru nejinformativnějších z nich, jakož i optimalizaci primerů, fluorescenčních značek a podmínek amplifikace, stejný tým autorů představil systém pro jednostupňovou multiplexní analýzu, včetně 12 markerů (tabulka 4; Li et al. , 2013a). Primery použité v tomto systému byly vybrány a označeny jedním ze čtyř fluorescenčních markerů (FAM, VIC, NED, PET), aby se rozsahy velikostí alel primerů se stejnými značkami nepřekrývaly.
Autoři provedli analýzu na zesilovači PTC200 (MJ Research, USA) pomocí souprav QIAGEN multiplexní PCR nebo souprav QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. Objem reakční směsi byl 12.5 ul. Podmínky amplifikace byly následující: pro QIAGEN multiplexní PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min.); Pro QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min).
Separace a vizualizace produktů PCR byly prováděny pomocí automatického analyzátoru kapilární DNA ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabulka 4. Charakteristiky 12 standardních markerů SSR použitých pro genotypizaci P. Infestans (Li et al., 2013a)
Jméno | Počet alel | Rozsah velikostí alely (bp) | Primery |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Příklad vizualizace výsledků analýzy je uveden na obr. 6. Výsledky byly analyzovány pomocí softwaru GeneMapper 3.7 porovnáním získaných dat s daty známých izolátů. Pro usnadnění interpretace výsledků analýzy je nutné do každé studie zahrnout 1–2 referenční izoláty se známým genotypem.
Navrhovaná metoda výzkumu byla testována na významném počtu polních vzorků, poté autoři standardizovali protokoly mezi laboratořemi dvou organizací, The James Hutton Institute (UK) a Wageningen University & Research (Nizozemsko), které spolu s možností použití standardních FTA karet pro zjednodušené sběr a přeprava vzorků DNA P. infestans umožnil hovořit o možnosti komerčního využití tohoto vývoje. Rychlá a přesná metoda genotypizace izolátů P. infestans pomocí multiplexní analýzy SSR navíc umožnila provádět standardizované studie populací tohoto patogenu v globálním měřítku a vytvoření světové databáze pozdních plísní v rámci projektu Eucablight (www.eucablight.org), včetně , včetně výsledků mikrosatelitní analýzy, umožnilo sledovat vznik a šíření nových genotypů po celém světě.
Zesílený polymorfismus délky restrikčních fragmentů (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) je technologie pro generování náhodných molekulárních markerů pomocí specifických primerů. V AFLP je DNA ošetřena kombinací dvou restrikčních enzymů. Specifické adaptéry jsou ligovány k lepivým koncům restrikčních fragmentů.
Tyto fragmenty se poté amplifikují pomocí primerů komplementárních k sekvenci adaptéru a restrikčnímu místu a navíc nesoucí jednu nebo více náhodných bází na svých 3 'koncích. Sada získaných fragmentů závisí na restrikčních enzymech a náhodně vybraných nukleotidech na 3'-koncích primerů (Vos et al., 1995). AFLP - genotypizace se používá k rychlému studiu genetické variace různých organismů.
Podrobný popis této metody je uveden v pracích Muellera, Wolfenbargera, 1999, Savelkoula a kol., 1999. Mnoho prací srovnávajících rozlišení metod AFLP a SSR provedli čínští vědci. Byly studovány fenotypové a genotypové charakteristiky 48 izolátů P. infestans shromážděných v pěti oblastech severní Číny. Na základě AFLP spekter bylo identifikováno osm různých genotypů DNA, na rozdíl od SSR genotypů, u nichž nebyla odhalena žádná diverzita (Guo et al., 2008).
Amplifikace pomocí primerů homologních se sekvencemi mobilních prvků
Markery odvozené ze sekvencí retrotranspozonů jsou velmi vhodné pro genetické mapování, studium genetické rozmanitosti a evolučních procesů (Schulman, 2006). Pokud jsou připraveny primery k doplnění stabilních sekvencí určitých mobilních prvků, je možné amplifikovat oblasti genomu umístěné mezi nimi. Ve studiích původce pozdní plíseň byla úspěšně použita metoda amplifikace genomových oblastí pomocí primeru komplementárního k základní sekvenci retroazonu SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) (Lavrova a Elansky, 2003). Pomocí této metody byly odhaleny rozdíly i u nepohlavních potomků jednoho izolátu. V tomto ohledu byl učiněn závěr, že metoda inter - SINE - PCR je vysoce specifická a rychlost pohybu prvků SINE v genomu Phytophthora je vysoká.
V genomu P. infestans bylo identifikováno 12 rodin krátkých retrotranspozonů (SINE); byla zkoumána druhová distribuce krátkých retrotranspozonů, byly identifikovány prvky (SINE), které se nacházejí v genomu pouze P. infestans (Lavrova, 2004).
Vlastnosti aplikace metod komparativní studie kmenů v populačních studiích
Při plánování studie je třeba jasně pochopit cíle, které sleduje, a používat vhodné metody. Některé metody tedy umožňují generovat velké množství nezávislých markerových znaků, ale zároveň mají nízkou reprodukovatelnost a silně závisí na použitých činidlech, reakčních podmínkách a kontaminaci testovaného materiálu. Proto je v každé studii skupiny kmenů nutné použít několik standardních (referenčních) izolátů, ale i v tomto případě je velmi obtížné kombinovat výsledky několika experimentů.
Tato skupina metod zahrnuje RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Po amplifikaci se získá velké množství fragmentů DNA různých velikostí. Je vhodné tyto techniky použít, pokud je nutné stanovit rozdíly mezi blízce příbuznými kmeny (rodič-potomstvo, mutanti divokého typu atd.), Nebo v případech, kdy je vyžadována podrobná analýza malého vzorku. Metoda AFLP je tedy široce používána v genetickém mapování P. infestans (van der Lee et al., 1997) a ve studiích intrapopulace (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Tyto metody jsou nevhodné pro použití při vytváření databází kmenů, protože je prakticky nemožné sjednotit účtování výsledků při provádění analýz v různých laboratořích.
Navzdory zdánlivé jednoduchosti a rychlosti provedení (izolace DNA bez dobrého čištění, amplifikace, vizualizace výsledků) vyžaduje tato skupina metod použití speciální metody pro dokumentaci výsledků: destilace v polyakrylamidovém gelu se značenými (radioaktivními nebo luminiscenčními) primery a následná expozice světlu nebo radioaktivnímu materiálu. Konvenční zobrazování na agarózovém gelu s ethidiumbromidem obecně není pro tyto metody vhodné, protože může se spojit velké množství fragmentů DNA různých velikostí.
Jiné metody naopak umožňují generovat malý počet funkcí s velmi vysokou reprodukovatelností. Tato skupina zahrnuje studium mitochondriálních haplotypů DNA (v Rusku jsou zaznamenány pouze dva haplotypy Ia a IIa), typy páření (většina izolátů se dělí na 2 typy: A1 a A2, zřídka se nachází samoplodný SF) a spektra izozymu peptidázy (dva lokusy Pep1 a Pep2 , skládající se ze dvou izozymů) a glukóza-6-fosfát izomerázy (v Rusku není pro tento znak žádná variabilita, ačkoli v jiných zemích světa je zaznamenán významný polymorfismus). Je vhodné tyto funkce použít při analýze sbírek, kompilaci regionálních a globálních databází. V případě analýzy izozymů a haplotypů mitochondriální DNA je možné se vůbec obejít bez standardních kmenů, zatímco při analýze typů páření jsou vyžadovány dva testované izoláty se známými typy páření.
Reakční podmínky a činidla mohou ovlivnit pouze kontrast produktu na elektroforetogramu; projevy artefaktů u těchto typů studií jsou nepravděpodobné.
V současné době je většina populací v evropské části Ruska zastoupena kmeny obou typů páření (tabulka 6), mezi nimi jsou i izoláty mitochondriální DNA typů Ia a IIa (jiné typy mtDNA nalezené na světě nebyly v Rusku po roce 1993 nalezeny). Spektra izozymů peptidázy jsou reprezentována dvěma genotypy na lokusu Pep1 (100/100, 92/92 a heterozygot 92/100 a genotyp 92/92 je extrémně vzácný (<0,3%)) a dvěma genotypy na lokusu Pep 2 (100/100 , 112/112 a heterozygot 100/112, přičemž genotyp 112/112 se vyskytuje méně často než 100/100, ale také poměrně často).
Po roce 6 (vymizení klonální linie US-1993) nebyla ve spektru izoenzymů glukóza-1-fosfát izomerázy žádná variabilita; všechny studované izoláty měly genotyp 100/100 (Elansky a Smirnov, 2002).
Třetí skupina metod umožňuje získat dostatečnou skupinu nezávislých markerových znaků s vysokou reprodukovatelností. Dnes tato skupina zahrnuje sondu RFLP-RG57, která produkuje 25-29 fragmentů DNA různých velikostí. RFLP-RG57 lze použít jak při analýze vzorků, tak při kompilaci databází. Tato metoda je však mnohem dražší než předchozí, je časově náročná a vyžaduje dostatečně velké množství vysoce purifikované DNA. Výzkumník je proto nucen omezit objem testovaného materiálu.
Vývoj RFLP-RG57 na počátku 90. let minulého století významně zintenzivnil populační studie původce pozdní plísně. Stal se základem metody založené na výběru a analýze „klonálních čar“ (viz níže). Spolu s RFLP-RG57 se k identifikaci klonálních linií používá párovací typ, DNA fingerprinting (metoda RFLP-RG57), spektra izoenzymů peptidázy a glukóza-6-fosfát izomerázy a typ mitochondriální DNA. Díky němu se ukázalo, al., 1994), bylo identifikováno nahrazení starých populací novými (Drenth et al., 1993, Sujkowski et al., 1994, Goodwin et al., 1995a) a byly identifikovány klonální linie, které převládají v mnoha zemích světa. Studie ruských kmenů pomocí této metody ukázaly vysoký genotypový polymorfismus kmenů evropské části a monomorfismus populací asijské a dalekovýchodní části Ruska (Elansky et al, 2001). A nyní tato metoda zůstává hlavní v populačních studiích P. infestans. Jeho široké distribuci však brání poměrně vysoká cena a náročnost práce při provádění.
Další slibnou technikou, která se ve studiích P. infestans používá jen zřídka, je analýza mikrosatelitních opakování (SSR). V současné době je tato metoda široce používána k izolaci klonálních linií. Pro analýzu kmenů byly široce používány (a nadále jsou používány) takové fenotypové znaky, jako je přítomnost genů virulence u odrůd brambor (Avdey, 1995, Ivanyuk a kol., 2002, Ulanova a kol., 2003) a rajčat. Geny virulence k odrůdám brambor již ztratily svoji hodnotu jako markerové rysy pro populační studie kvůli výskytu maximálního (nebo blízkého) počtu genů virulence u velké většiny izolátů. Současně se gen virulence T1 pro kultivary rajčat nesoucích odpovídající gen Ph1 stále úspěšně používá jako znakový znak (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
V mnoha studiích se jako marker používá rezistence na fungicidy. Tuto vlastnost je nežádoucí použít v populačních studiích kvůli poměrně snadnému vzhledu mutací rezistence v klonálních liniích po aplikaci fungicidů obsahujících metalaxyl- (nebo mefenoxam-). Například významné rozdíly v úrovni rezistence byly ukázány v klonální linii Sib1 (Elansky et al., 2001).
Typ páření, peptidázové izoenzymové spektrum, typ mitochondriální DNA, RFLP-RG57, SSR jsou tedy preferovanými rysy markerů pro vytváření databází a značení kmenů ve sbírkách. Chcete-li porovnat omezené vzorky, je-li nutné použít maximální počet funkcí markerů, můžete použít AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (tabulka 5). Mělo by se však pamatovat na to, že tyto metody jsou špatně reprodukovatelné a v každém jednotlivém experimentu (cyklus amplifikační elektroforézy) je nutné použít několik referenčních izolátů.
Tabulka 5. Srovnání různých metod výzkumu kmenů P. infestans
kritérium | TC | Isofer policajti | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Množství informací | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reprodukovatelnost | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Možnost artefaktů | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Stát | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intenzita práce | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Rychlost analýzy ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Poznámka: H - nízká, C - střední, B - vysoká; НС * - intenzita práce je nízká při použití agarózového gelu nebo automatického
genotyp, střední - destilací v polyakrylamidovém gelu se značenými primery,
** - nepočítáme čas strávený pěstováním mycelia pro izolaci DNA.
Populační struktura
Klonální čáry
Při absenci rekombinace nebo jejího nevýznamného příspěvku ke struktuře populace tvoří populaci určitý počet klonů, jejichž genetické výměny jsou extrémně vzácné.
V takových populacích je informativnější studovat ne frekvence jednotlivých genů, ale frekvence genotypů, které mají společný původ (klonální linie nebo klonální linie) a liší se pouze bodovými mutacemi. Populační studie patogenu pozdní plíseň a analýza klonálních linií se od příchodu metody RFLP-RG57 na počátku 90. let minulého století výrazně zrychlily. Spolu s RFLP-RG57 se k identifikaci klonálních linií používá párovací typ, spektra izoenzymů peptidázy a glukóza-6-fosfát izomerázy a typ mitochondriální DNA. Charakteristiky nejběžnějších klonálních linií jsou uvedeny v tabulce 6.
Klon US-1 dominoval populaci všude až do konce 80. let, poté byl nahrazen jinými klony a zmizel z Evropy a Severní Ameriky. Nyní se vyskytuje na Dálném východě (Filipíny, Tchaj-wan, Čína, Japonsko, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al., 1993), v Africe (Uganda, Keňa, Rwanda, Goodwin et al., 1994, Vega-Sanchez et. al., 2000; Ochwo et al., 2002) a v Jižní Americe (Ekvádor, Brazílie, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Pouze v Austrálii nebyly identifikovány žádné kmeny patřící do linie US-1. Zdá se, že izoláty P. infestans přišly do Austrálie s další migrační vlnou (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migroval ze severního Mexika do Kalifornie na konci 70. let a po 32 letech bez nákazy způsobil epidemii brambor a rajčat. Díky své vysoké agresivitě vytlačil klon US-1 a začal dominovat na západním pobřeží Spojených států (Goodwin et al., 1995a).
Genotypy US-7 a US-8 byly objeveny ve Spojených státech v roce 1992 a již v roce 1994 byly široce distribuovány ve Spojených státech a Kanadě. Během jedné polní sezóny je klon US-8 schopen téměř úplně vytěsnit klon US-1 na pozemcích brambor původně infikovaných oběma klony ve stejné koncentraci (Miller a Johnson, 2000).
Klony BC-1 až BC-4 byly identifikovány v Britské Kolumbii u malého počtu izolátů od Goodwina a kol., 1995b). Klon US-11 se ve Spojených státech rozšířil a nahradil US-1 na Tchaj-wanu. Klony JP-1 a EC-1 jsou společně s klonem US-1 běžné v Japonsku a Ekvádoru (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 je klon, který v Rusku převládal nad rozsáhlým územím od Moskevské oblasti po Sachalin. V Moskevské oblasti byla objevena v roce 1993 a některé populace v terénu sestávaly hlavně z kmenů této klonální linie, vysoce rezistentních vůči metalaxylu. Po roce 1993 se prevalence tohoto klonu významně snížila. Mimo Ural v letech 1997-1998 byl SIB-1 nalezen všude, s výjimkou území Khabarovsk (tam je rozšířený klon SIB-2). Prostorové oddělení klonů s různými typy páření vylučuje sexuální proces na Sibiři a na Dálném východě. V Moskevské oblasti je na rozdíl od Sibiře populace zastoupena mnoha klony; téměř každý izolát má jedinečný multilokusový genotyp (Elansky et al., 2001, 2015). Tuto rozmanitost nelze vysvětlit pouze dovozem kmenů hub z různých částí světa s dovezeným semenným materiálem. Jelikož se v populaci vyskytují oba typy páření, je možné, že jeho rozmanitost je způsobena také rekombinací. V Britské Kolumbii se tedy předpokládá vznik genotypů BC-2, BC-3 a BC-4 v důsledku hybridizace klonů BC-1 a US-6 (Goodwin et al., 1995b). Je možné, že hybridní kmeny se vyskytují v populacích Moskvy. Například kmeny MO-4, MO-8 a MO-11 heterozygotní pro lokus PEP mohou být hybridy mezi kmeny MO-12, MO-21, MO-22, které mají typ párování A2 a homozygotní pro jednu alelu lokusu PEP a kmen MO-8, mající typ páření A1 a homozygotní pro druhou alelu lokusu. A pokud tomu tak je, a v moderní populaci P. infestans existuje tendence ke zvýšení role sexuálního procesu, pak se sníží informační hodnota analýzy multilokusových klonů (Elansky et al., 2001, 2015).
Variace klonálních linií
Až do 90. let 20. století byla ve světě rozšířená klonová linie US-1. Většina polní a regionální populace sestávala výhradně z kmenů s genotypem US-1. Byly však také pozorovány rozdíly mezi izoláty, pravděpodobně způsobené mutačním procesem. Mutace se vyskytovaly jak v jaderné, tak v mitochondriální DNA a ovlivňovaly mimo jiné úroveň rezistence na fenylamidové léky a počet genů virulence. Řádky, které se liší od původních genotypů mutacemi, jsou označeny dalšími čísly za tečkou za názvem původního genotypu (například mutantní linie US-1.1 klonální linie US-1). Fingerprintingové DNA linie US-1.5 a US-1.6 obsahují doplňkové linie různých velikostí (Goodwin et al., 1995a, 1995b); klonální linie US-6.3 se také liší od US-6 o jednu doplňkovou linii (Goodwin, 1997, tabulka 7).
Při studiu mitochondriální DNA bylo zjištěno, že v klonální linii US-1 se nachází pouze mitochondriální DNA typu 1b (Carter et al., 1990). Při studiu kmenů této klonální linie z Peru a Filipín však byly nalezeny izoláty, jejichž typy mitochondriální DNA se od 1b lišily přítomností inzercí a delecí (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabulka 6. Multilokusové genotypy některých klonálních linií P. infestans
Jméno | Typ páření | Isozymes | DNA otisky prstů | Typ MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Poznámka: * - žádná data.
Tabulka 7. Multilokusové genotypy a jejich mutantní linie
Jméno | Typ páření | | DNA otisky prstů (RG57) | Poznámky | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Původní genotyp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutace v PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutace v RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutace v RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutace v RG57 a PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutace v RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Původní genotyp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutace v PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutace v RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutace v RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutace v RG57 a PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutace v RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Původní genotyp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutace v RG57 |
Existují také změny ve spektrech izozymů. Jsou zpravidla způsobeny rozpadem organismu zpočátku heterozygotního pro tento enzym na homozygotní. V roce 1993 jsme na plodech rajčat identifikovali kmen s charakteristikami charakteristickými pro US-1: otisky prstů RG57, typ mitochondriální DNA a genotyp 86/100 pro glukózo-6-fosfatizomeru, ale byl homozygotní (100/100) pro první lokus peptidázy místo heterozygot 92/100 typický pro tuto klonální linii. Genotyp tohoto kmene jsme pojmenovali MO-17 (tabulka 6). Mutantní linie US-1.1 a US-1.4 se také liší od US-1 mutacemi na prvním místě peptidázy (tabulka 7).
Mutace vedoucí ke změnám v počtu genů virulence u odrůd brambor a rajčat jsou poměrně běžné. Byly zaznamenány mezi izoláty klonální linie US-1 v populacích z Nizozemska (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polska (Sujkowski et al., 1991), severní Severní Ameriky (Goodwin et al., ., 1995b). Rozdíly v počtu genů virulence brambor byly zaznamenány také u izolátů klonálních linií US-7 a US-8 v Kanadě a Spojených státech (Goodwin et al., 1995a), u izolátů linie SIB-1 v asijské části Ruska (Elansky et al, 2001 ).
V monoklonálních polních populacích byly identifikovány izoláty se silnými rozdíly v úrovních rezistence na fenylamidové léky, které všechny patřily do klonální linie Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabulka 1). Téměř všechny kmeny klonální linie US-1 jsou vysoce citlivé na metalaxyl; vysoce rezistentní izoláty této linie však byly izolovány na Filipínách (Koh et al., 1994) a v Irsku (Goodwin et al., 1996).
Moderní populace P. infestans
Střední Amerika (Mexiko)
Populace P. infestans v Mexiku se výrazně liší od ostatních světových populací, což je způsobeno především historickou polohou. Četné studie této populace a příbuzných druhů P. infestans z kmene Phytophthora, stejně jako místních druhů rodu Solanum, vedly k závěru, že vývoj patogenu v centrální části Mexika probíhal společně s vývojem hostitelských rostlin a byl spojen se sexuální rekombinací (Grünwald, Flier , 2005). Oba typy páření jsou zastoupeny v populaci a ve stejném poměru a přítomnost oospor v půdě, na rostlinách a hlízách brambor a volně rostoucích příbuzných druhů Solanum potvrzuje přítomnost pohlavního procesu v populaci (Fernández-Pavía et al., 2002). Nedávné studie údolí Toluca a jeho okolí (předpokládaného centra původu patogenu) potvrdily vysokou genetickou rozmanitost místní populace P. infestans (134 multilocus genotypů ve vzorku 176 vzorků) a přítomnost několika diferencovaných subpopulací v regionu (Wang et al., 2017). Faktory přispívající k této diferenciaci jsou prostorové rozdělení subpopulací charakteristických pro vysočiny středního Mexika, rozdíly v kultivačních podmínkách a odrůdách brambor používaných v údolích a horách a přítomnost divokých hlíznatých druhů Solanum, které mohou působit jako alternativní hostitelé (Fry et al.) ., 2009).
Je však třeba poznamenat, že populace P. infestans v severním Mexiku jsou spíše klonální a více podobné severoamerickým populacím, což může naznačovat, že se jedná o nové genotypy (Fry et al., 2009).
Severní Amerika
Severoamerické populace P. infestans měly vždy velmi jednoduchou strukturu a jejich klonální charakter byl prokázán dlouho před použitím mikrosatelitní analýzy. Do roku 1987 dominovala ve Spojených státech a Kanadě klonální linie US-1 (Goodwin et al., 1995). V polovině 70. let, kdy se objevily fungicidy na bázi metalaxylu, začal být tento klon nahrazen jinými, odolnějšími genotypy, které migrovaly z Mexika (Goodwin et al., 1998). Na konci 90. let. genotyp US-8 zcela nahradil genotyp US-1 ve Spojených státech a stal se dominantní klonální linií brambor (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). U rajčat, která neustále obsahovala několik klonálních linií, byla situace odlišná a jejich složení se z roku na rok měnilo (Fry et al., 2009).
V roce 2009 vypukla ve Spojených státech rozsáhlá epidemie pozdní plíseň na rajčatech. Rysem této pandemie byl její téměř současný nástup na mnoha místech severovýchodních Spojených států a ukázalo se, že je spojen s masivním prodejem infikovaných sazenic rajčat ve velkých zahradních centrech (Fry et al., 2013). Ztráty na úrodě byly obrovské. Mikrosatelitová analýza postižených vzorků odhalila, že pandemický kmen patřil k páření klonální linie US-22 A2. V roce 2009 dosáhl podíl tohoto genotypu v americké populaci P. infestans 80% (Fry et al., 2013). V následujících letech se podíl agresivních genotypů US-23 (hlavně na rajčatech) a US-24 (na bramborách) v populaci neustále zvyšoval, avšak po roce 2011 se míra detekce US-24 významně snížila a k dnešnímu dni asi 90% populace patogenů v Spojené státy jsou zastoupeny genotypem USA-23 (Fry et al., 2015).
V Kanadě, stejně jako ve Spojených státech, na konci 90. let. dominantní genotyp US-1 byl nahrazen US-8, jehož dominantní postavení zůstalo nezměněno až do roku 2008. V Kanadě se vyskytly vážné epidemie pozdní plísně spojené s prodejem infikovaných sazenic rajčat, ale byly způsobeny genotypy US-2009 a US-2010 (Kalischuk et al., 23). Jasná geografická diferenciace těchto genotypů byla pozoruhodná: USA-8 dominovaly v západních provinciích Kanady (2012%), zatímco USA-23 dominovaly ve východních provinciích (68%). V následujících letech se USA-8 rozšířily do východních oblastí; obecně se však jejich podíl na populaci mírně snížil na pozadí výskytu genotypů US-83 a US-23 v zemi (Peters et al., 22). K dnešnímu dni si US-24 udržuje dominantní postavení v celé Kanadě; USA-2014 jsou přítomny v Britské Kolumbii, zatímco USA-23 a USA-8 jsou přítomny v Ontariu (Peters, 23).
Severoamerické populace P. infestans jsou tedy hlavně klonálními liniemi. Za posledních 40 let počet detekovaných klonálních genotypů dosáhl 24. Navzdory skutečnosti, že v populaci jsou přítomny kmeny obou typů páření, pravděpodobnost výskytu nových genotypů v důsledku sexuální rekombinace zůstává poměrně nízká. Nicméně v posledních 20 letech bylo zaznamenáno několik případů výskytu efemérních rekombinantních populací (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), a v jednom případě byl výsledkem křížení genotyp US-11 , který se v Severní Americe zakořenil po mnoho let (Gavino et al., 2000). Do roku 2009 byly změny ve struktuře populací spojeny se vznikem nových agresivnějších genotypů s jejich následnou migrací a přemisťováním dříve dominantních předchůdců. Co se stalo v letech 2009–2010 V USA a Kanadě epifytotika poprvé ukázala, že v éře globalizace mohou být ohniska nemoci spojena s aktivním šířením nových genotypů při prodeji infikovaného sadbového materiálu.
Jižní Amerika
Až donedávna nebyly studie jihoamerických populací P. infestans pravidelné ani rozsáhlé. Je známo, že struktura těchto populací je poměrně jednoduchá a zahrnuje 1-5 klonálních linií na zemi (Forbes et al., 1998). Do roku 1998 byly tedy na bramborách nalezeny genotypy US-1 (Brazílie, Chile) BR-1 (Brazílie, Bolívie, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ekvádor, Kolumbie, Peru a Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 a AR-5 (Argentina), PE-3 a PE-7 (jižní Peru). Páření typu A2 se vyskytovalo v Brazílii, Bolívii a Argentině a nebylo nalezeno za bolívijsko-peruánskou hranicí v oblasti jezera Titicaca, za níž v Andách dominoval genotyp EC-1 A1. U rajčat zůstal US-1 dominantním genotypem v celé Jižní Americe.
Situace víceméně přetrvávala v roce 2000. Důležitým bodem byl objev nové klonální linie EC-2 typu A2 v severních Andách u příbuzných brambor (S. brevifolium a S. tetrapetalum), kteří rostou ve volné přírodě (Oliva et al., 2010). Fylogenetické studie ukázaly, že tato linie není zcela identická s P. infestans, i když s ní úzce souvisí, v souvislosti s níž bylo navrženo ji zvážit, stejně jako další linie, EC-3, izolovaná z rajčatového stromu S. betaceum rostoucího v Andách, nový druh zvaný P. andina; stav tohoto druhu (nezávislý druh nebo hybrid P. infestans s nějakou dosud neznámou linií) je však stále nejasný (Delgado et al., 2013).
V současné době jsou všechny jihoamerické populace P. infestans klonální. Navzdory přítomnosti obou typů páření nebyly identifikovány žádné rekombinantní populace. U rajčat je genotyp US-1 všudypřítomný, zjevně vytlačený z brambor místními kmeny, jejichž přesný původ je stále neznámý. V Brazílii, Bolívii a Uruguayi je přítomen genotyp BR-1; v Peru, spolu s USA-1 a EC-1, existuje několik dalších místních genotypů. V Andách si dominantní postavení zachovává klonální linie EC-1, jejíž vztah s nedávno objevenou P. andina zůstává neznámý. Jediné „nestabilní“ místo, kde na období 2003–2013. došlo k významným změnám v populaci, stala se Chile (Acuña et al., 2012), kde v letech 2004-2005. populace patogenů se stala charakterizována rezistencí vůči metalaxylu a novým haplotypem mitochondriální DNA (Ia místo dříve přítomného Ib). 2006 až 2011 v populaci dominoval genotyp 21 (podle SSR), jehož podíl dosáhl 90%, poté dlaň přešla na genotyp 20, jehož frekvence výskytu se v příštích dvou letech udržovala na přibližně 67% (Acuña, 2015).
Evropa
V historii Evropy došlo k nejméně dvěma migračním vlnám P. infestans ze Severní Ameriky: v 1. století. (HERB-1) a počátkem 70. století (US-1). Všudypřítomná distribuce fungicidů obsahujících metalaxyl v XNUMX. letech. vedlo k přemístění dominantního genotypu US-XNUMX a jeho nahrazení novými genotypy. Výsledkem je, že ve většině západoevropských zemí byly populace patogenu zastoupeny hlavně několika klonálními liniemi.
Použití analýzy mikrosatelitů k analýze populací patogenů umožnilo identifikovat závažné změny, ke kterým došlo v západní Evropě v letech 2005–2008. V roce 2005 byla ve Velké Británii objevena nová klonální linie s názvem 13_A2 (nebo „Modrá 13“), která je charakterizována typem páření A2 , vysoká agresivita a odolnost vůči fenylamidům (Shaw et al., 2007). Stejný genotyp byl nalezen ve vzorcích odebraných v roce 2004 v Nizozemsku a severní Francii, což naznačuje, že migroval do Velké Británie z kontinentální Evropy, pravděpodobně se sadbovými bramborami (Cooke et al., 2007). Studie genomu zástupců této klonální linie ukázala vysokou míru polymorfismu její sekvence (do roku 2016 počet jejích subklonálních variací dosáhl 340) a významnou míru variability v úrovni genové exprese, vč. efektorové geny během infekce rostlin (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Tyto vlastnosti, spolu se zvýšeným trváním biotrofické fáze, by mohly způsobit zvýšenou agresivitu 13_A2 a její schopnost infikovat i odrůdy brambor odolné vůči pozdní plísni.
V příštích několika letech se genotyp rychle rozšířil do zemí severozápadní Evropy (Velká Británie, Irsko, Francie, Belgie, Nizozemsko, Německo) se současným vytěsněním dříve dominantních genotypů 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Podle webové stránky www.euroblight.net dosáhl podíl 13_A2 v populacích těchto zemí 60-80% a více; přítomnost tohoto genotypu byla také zaznamenána v některých zemích východní a jižní Evropy. Avšak v letech 2009-2012. 13_A2 ztratila dominantní postavení ve Velké Británii a Francii, čímž se vzdala linie 6_A1 (8_A1 v Irsku), a v Nizozemsku a Belgii byla částečně nahrazena genotypy 1_A1, 6_A1 a 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
K dnešnímu dni je asi 70% západoevropské populace P. infestans monoklonální. Podle webové stránky www.euroblight.net jsou dominantní genotypy v zemích severozápadní Evropy (Velká Británie, Francie,
Nizozemsko, Belgie) zůstávají, přibližně ve stejném poměru, 13_A2 a 6_A1 a druhý se prakticky nevyskytuje mimo specifikovaný region (s výjimkou Irska), ale již má alespoň 58 subklonů (Cooke, 2017). Varianty 13_A2 jsou ve znatelném počtu přítomny v Německu a sporadicky jsou pozorovány také v zemích střední a jižní Evropy. Genotyp 1_A1 tvoří významnou část populace Belgie a částečně Nizozemska a Francie. Genotyp 8_A1 se v evropské populaci stabilizoval na úrovni 3–6%, s výjimkou Irska, kde si zachovává svoji vedoucí pozici a je rozdělen do dvou subklonů (Stellingwerf, 2017). A konečně v roce 2016 byl zaznamenán nárůst frekvence výskytu nových genotypů 36_A2 a 37_A2, poprvé zaznamenaných v letech 2013–2014; k dnešnímu dni se tyto genotypy vyskytují v Nizozemsku a Belgii a částečně ve Francii a Německu a také v jižní části Velké Británie (Cooke, 2017). Přibližně 20–30% populace západní Evropy je každý rok zastoupeno jedinečnými genotypy.
Na rozdíl od západní Evropy nebyly v době, kdy se objevil genotyp 13_A2, populace severní Evropy (Švédsko, Norsko, Dánsko, Finsko) zastoupeny nikoli klonálními liniemi, ale velkým množstvím jedinečných genotypů (Brurberg et al.,
2011). Během období aktivního šíření 13_A2 v západní Evropě byla přítomnost tohoto genotypu ve Skandinávii zaznamenána až v roce 2011, kdy byl poprvé objeven v Severním Jutsku (Dánsko), kde se pěstují hlavně průmyslové odrůdy brambor s aktivním využitím metalaxylu obsahujícího fungicidy (Nielsen et al., 2014). Podle www.euroblight.net byl genotyp 13_A2 detekován také u několika vzorků z Norska a Dánska v roce 2014 a u několika norských vzorků v roce 2016; v roce 2013 byla navíc ve Finsku zaznamenána přítomnost genotypu 6_A1 v malém množství. Za hlavní důvod selhání 13_A2 a dalších klonálních linií při dobytí Skandinávie jsou považovány klimatické rozdíly tohoto regionu od zemí západní Evropy.
Kromě toho, že chladná léta a chladné zimy přispívají k přežití ani ne tak vegetativního mycelia jako oospor (Sjöholm et al., 2013), zmrazení půdy v zimě (které se obvykle v teplejších zemích západní Evropy nevyskytuje) přispívá k synchronizaci klíčení a výsadby oospor. brambor, což zvyšuje jejich roli jako zdroje primární infekce (Brurberg et al., 2011). Je třeba také poznamenat, že na severu vývoj infekce z oporů převyšuje vývoj tuberózní infekce, což v konečném důsledku brání dominanci ještě agresivnějších, ale později vyvinutých klonálních linií (Yuen, 2012). Struktura nejvíce studovaných populací P. infestans ve východní Evropě (Polsko, pobaltské státy) je velmi podobná struktuře ve Skandinávii.
Jsou zde také přítomny oba typy páření a drtivá většina genotypů určených analýzou SSR je jedinečná (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Stejně jako v severní Evropě distribuce klonálních linií (primárně genotypu 13_A2) prakticky neovlivnila místní populace patogenu, které si zachovávají vysokou úroveň diverzity při absenci výrazných dominantních linií.
Přítomnost 13_A2 je příležitostně pozorována na polích s komerčními odrůdami brambor. V Rusku se situace vyvíjí podobně. Mikrosatelitní analýza izolátů P. infestans shromážděných v letech 2008-2011 v 10 různých regionech evropské části Ruska vykazovaly vysoký stupeň genotypové rozmanitosti a úplný nedostatek shod s evropskými klonálními liniemi (Statsyuk et al., 2014). O několik let později ukázala studie vzorků P. infestans shromážděných v Leningradské oblasti v letech 2013-2014 významné rozdíly mezi nimi a genotypy z této oblasti identifikovanými v předchozí studii. V obou studiích nebyly nalezeny žádné západoevropské genotypy (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Vysoká genetická rozmanitost východoevropských populací P. infestans a absence dominantních klonálních linií v nich může být způsobena několika důvody. Zaprvé, stejně jako v severní Evropě, přispívají klimatické podmínky zvažovaných zemí k tvorbě oospór jako primárního zdroje infekce (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Zadruhé, významná část brambor vypěstovaných v těchto zemích se pěstuje na malých soukromých farmách, často obklopených lesy nebo jinými překážkami volného pohybu infekčního materiálu (Chmielarz et al., 2014). Brambory pěstované v takových podmínkách zpravidla nejsou ošetřeny chemickými látkami a výběr odrůd je založen na jejich odolnosti vůči pozdní plísni, tj. neexistuje žádný selektivní tlak na agresivitu a rezistenci na metalaxyl, který zbavuje rezistentní genotypy, jako je 13_A2, výhod oproti jiným genotypům (Chmielarz et al., 2014). A konečně, vzhledem k malé velikosti pozemků, jejich majitelé obvykle neprovádějí střídání plodin a pěstují brambory na stejném místě po celá léta, což přispívá k hromadění geneticky rozmanitého inokula (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asie
Až donedávna zůstávala struktura populací P. infestans v Asii poměrně špatně pochopena. Bylo známo, že je zastoupena hlavně klonálními liniemi, a účinek sexuální rekombinace na vznik nových genotypů je velmi malý. Tak například v letech 1997-1998. V asijské části Ruska (Sibiř a Dálný východ) byla populace patogenů zastoupena pouze třemi genotypy s převahou genotypu SIB-1 (Elansky et al., 2001). Přítomnost linií klonálních patogenů byla prokázána v zemích jako Čína, Japonsko, Korea, Filipíny a Tchaj-wan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klonální linie US-1, která dominovala nad velkým územím Asie, na konci 90. let - počátkem roku 2000. téměř všude začaly být nahrazovány jinými genotypy, které zase ustupovaly novým. Ve většině případů byly změny ve struktuře a složení populací v asijských zemích spojeny s migrací nových genotypů zvenčí. Takže v Japonsku, s výjimkou genotypu JP-3, mají všechny ostatní japonské genotypy, které se objevily po US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), víceméně prokázaný vnější původ (Akino et al., 2011) ... V Číně v současné době existují tři hlavní populace patogenů s jasným zeměpisným rozdělením; Mezi těmito populacemi není žádný nebo velmi slabý tok genů (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotyp 13_A2 se objevil na území Číny v jejích jižních provinciích (Yunnan a Sichuan) v letech 2005-2007 a v letech 2012-1014. byl také pozorován na severovýchodě země (Li et al., 2013b). V Indii se 13_A2 objevila pravděpodobně ve stejnou dobu jako v Číně, s největší pravděpodobností u infikovaných sadbových brambor (Chowdappa et al., 2015), a v letech 2009–2010. způsobila vážné epifytotické onemocnění pozdní plíseň na rajčatech na jihu země, poté se rozšířila na brambory a v roce 2014 způsobila vypuknutí pozdní plíseň v Západním Bengálsku, což vedlo ke zničení a sebevraždě mnoha místních farmářů (Fry, 2016).
Afrika
Do roku 2008-2010 systematické studie P. infestans v afrických zemích nebyly provedeny. V současné době lze africké populace P. infestans rozdělit do dvou skupin a toto rozdělení je jednoznačně spojeno se skutečností dovozu sadbových brambor z Evropy.
V severní Africe, která aktivně dováží sadbové brambory z Evropy, je typ páření A2 široce zastoupen téměř ve všech regionech, což poskytuje teoretickou možnost vzniku nových genotypů v důsledku sexuální rekombinace (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Kromě toho je v Alžírsku zaznamenána přítomnost genotypů 13_A2, 2_A1 a 23_A1 s výraznou dominancí prvního z nich, stejně jako postupné snižování podílu jedinečných genotypů k úplnému vymizení (Rekad et al., 2017). Na rozdíl od zbytku regionu je v Tunisku (s výjimkou severovýchodu země) populace patogenů zastoupena hlavně typem páření A1 (Harbaoui et al., 2014).
Klonální linie NA-01 je zde dominantní. Obecně je podíl klonálních linií v populaci pouze 43%. Ve východní a jižní Africe, kde je objem importu osiva mizivě malý (Fry et al., 2009), je P. infestans reprezentován pouze dvěma klonálními liniemi typu A1, US-1 a KE-1, a druhý aktivně vytěsňuje první na bramborách ( Pule a kol., 2012; Njoroge a kol., 2016). K dnešnímu dni mají oba tyto genotypy znatelný počet subklonálních variací.
Austrálie
První zpráva o pozdní plísni na bramborách v Austrálii pochází z roku 1907 a první epifytóza, pravděpodobně způsobená silnými dešti v letních měsících, se objevila v letech 1909-1911. (Drenth a kol., 2002). Obecně však pozdní plíseň nemá pro zemi žádný významný ekonomický význam. Sporadická ohniska pozdní plíseň, vyvolaná povětrnostními podmínkami, které zajišťují vysokou vlhkost, se nevyskytují častěji než jednou za 5-7 let a jsou lokalizována hlavně v severní Tasmánii a střední Victorii. V souvislosti s výše uvedeným prakticky chybí publikace věnované studiu struktury australské populace P. infestans. Poslední dostupné informace jsou z let 1998-2000. (Drenth a kol., 2002). Podle autorů byla populace státu Victoria klonální linií US-1.3, což nepřímo potvrdilo migraci tohoto genotypu ze Spojených států. Tasmánské vzorky byly klasifikovány jako AU-3, odlišné od genotypů, které byly v té době přítomny v jiných částech světa.
Vlastnosti vývoje pozdní plíseň v Rusku
V Evropě se infekce zavádí nemocnými hlízami semen, oospory, které přezimovaly v půdě, a také zoosporangiemi, které přinesl vítr z rostlin vypěstovaných z přezimovaných hlíz na loňských polích („dobrovolnické“ rostliny) nebo na hromadách vyřazených záložka pro skladování hlíz. Z nich jsou rostliny pěstované na hromadách vyřazených hlíz považovány za nejnebezpečnější zdroj infekce. tam je počet naklíčených hlíz často významný a zoosporangie z nich lze přenášet na velké vzdálenosti. Zbytek zdrojů (oospory, „dobrovolnické“ rostliny) nejsou tak nebezpečné, protože není zvykem pěstovat rostliny na stejných polích častěji než jednou za 3-4 roky. Infekce nemocnými hlízami osiva je také minimální díky dobrému systému kontroly kvality osiva.
Obecně je množství inokula v evropských populacích omezené, a proto je nárůst epidemie poměrně pomalý a lze jej úspěšně regulovat chemickými fungicidními přípravky. Hlavním úkolem v evropských podmínkách je boj proti infekci ve fázi, kdy začíná hromadné šíření zoosporangií z postižených rostlin.
V Rusku je situace radikálně odlišná. Většina plodin brambor a rajčat se pěstuje v malých soukromých zahradách; ochranná opatření na nich buď nejsou prováděna vůbec, nebo jsou fungicidní ošetření prováděna v nedostatečném počtu a začínají po výskytu pozdní plíseň na vrcholcích. Výsledkem je, že soukromé zeleninové zahrady působí jako hlavní zdroj infekce, odkud jsou zoosporangie přenášeny větrem na komerční výsadby. To potvrzují naše přímá pozorování v regionech Moskva, Brjansk, Kostroma, Rjazaň: poškození rostlin v soukromých zahradách je pozorováno ještě před zahájením fungicidního ošetření komerčních výsadb. Následně je epidemie na velkých polích omezena použitím fungicidních přípravků, zatímco v soukromých zahradách dochází k rychlému rozvoji plísně pozdní.
V případě nesprávného nebo „rozpočtového“ zacházení s komerčními výsadbami se na polích objevují ložiska plísně; později se aktivně rozvíjejí a pokrývají stále větší oblasti (Elansky, 2015). Infekce v soukromých zahradách má významný dopad na epidemie v komerčních oblastech. Ve všech regionech pěstování brambor v Rusku je plocha obsazená bramborami v soukromých zahradách několikanásobně větší než celková plocha polí velkých producentů. V takovém prostředí lze soukromé zeleninové zahrady považovat za globální zdroj inokula pro komerční pole. Pokusme se identifikovat ty vlastnosti, které jsou charakteristické pro genotypy kmenů v soukromých zahradách.
Výsadba neosiva a karanténní kontrola konzumních brambor, semen rajčat získaných od pochybných zahraničních výrobců, dlouhodobé pěstování brambor a rajčat na stejných plochách, nesprávné fungicidní ošetření nebo jejich úplná absence vedou k závažným epifytotům v soukromém sektoru, jejichž výsledek je zdarma křížení, hybridizace a tvorba oospór v soukromých zahradách. Ve výsledku je pozorována velmi vysoká genotypová diverzita patogenu, když téměř každý kmen je jedinečný svým genotypem (Elansky et al., 2001, 2015). Díky výsadbě sadbových brambor různého genetického původu je nepravděpodobné, že se objeví klonální linie specializované na napadení jakékoli odrůdy. Kmeny vybrané v takovém případě se vyznačují svou univerzálností ve vztahu k postiženým odrůdám, většina z nich má téměř maximální počet genů virulence. Tím se velmi liší od systému „klonálních linií“ typických pro velká pole zemědělských podniků se správně nainstalovaným systémem ochrany proti plísni. „Klonální linie“ (jsou-li všechny kmeny patogenu pozdní plísně v terénu zastoupeny jedním nebo více genotypy) jsou všudypřítomné v zemích, kde pěstování brambor provádějí výhradně velké farmy: USA, Nizozemsko, Dánsko atd. V Anglii, Irsku, Polsku, kde jsou tradičně rozšířené také pozemky pro domácnost při pěstování brambor existuje také vyšší genotypová rozmanitost v soukromých zahradách. Na konci 20. století byly „klonální linie“ rozšířené v asijských a dalekovýchodních částech Ruska (Elansky et al., 2001), což je zjevně způsobeno používáním stejných odrůd brambor výhradně k pěstování. Nedávno se také situace v těchto regionech začala měnit směrem ke zvýšení genotypové rozmanitosti populací.
Nedostatek intenzivního ošetření fungicidními přípravky má další přímý důsledek - nedochází k hromadění rezistentních kmenů v zahradách. Naše výsledky skutečně ukazují, že kmeny rezistentní na metalaxyl se vyskytují mnohem méně často v soukromých zahradách než v komerčních výsadbách.
Úzká blízkost výsadby brambor a rajčat, typická pro soukromé zahrady, usnadňuje migraci kmenů mezi těmito plodinami, což má za následek, že v posledním desetiletí byl mezi kmeny izolovanými z brambor podíl kmenů nesoucích gen rezistence na odrůdy cherry rajčat (T1), dříve charakteristický pouze pro rajčatové kmeny. Kmeny s genem T1 jsou ve většině případů vysoce agresivní vůči bramborám i rajčatům.
V posledních letech se pozdní plíseň na rajčatech začala objevovat v mnoha případech dříve než na bramborách. Sazenice rajčat mohou být napadeny oospórami v půdě nebo oospórami přítomnými v semenech rajčat nebo k nim přilnout (Rubin et al., 2001). Za posledních 15 let se v obchodech objevilo velké množství levných balených semen, převážně dovážených, a většina malých producentů přešla na jejich používání. Semena mohou obsahovat kmeny s genotypy typickými pro oblasti jejich kultivace. V budoucnu budou tyto genotypy zahrnuty do sexuálního procesu v soukromých zahradách, což povede ke vzniku zcela nových genotypů.
Lze tedy konstatovat, že soukromé zahrady jsou globálním „tavicím kotlem“, ve kterém se v důsledku výměny genetického materiálu zpracovávají stávající genotypy a objevují se zcela nové. Jejich výběr navíc probíhá za podmínek, které se velmi liší od podmínek vytvořených pro brambory ve velkých farmách: absence fungicidního lisu, odrůdová uniformita výsadby, převaha rostlin ovlivněných různými formami virové a bakteriální infekce, blízkost rajčat a divokých nočních stínů, aktivní křížení a tvorba oospór, možnost aby oospory fungovaly jako zdroj infekce pro příští rok.
To vše vede k velmi vysoké genotypové rozmanitosti populací dvorku. V podmínkách epifytotiky v zeleninových zahradách se pozdní plíseň šíří velmi rychle a uvolňuje se obrovské množství spór, které létají do nedalekých komerčních výsadb. Po vstupu na komerční pole se správným systémem zemědělské technologie a chemické ochrany však spor, které dorazily, nemá prakticky žádnou příležitost zahájit epifytotiku v této oblasti, což je způsobeno absencí klonálních linií, které jsou odolné vůči fungicidům a specializují se na pěstovanou odrůdu.
Dalším zdrojem primárního inokula mohou být nemocné hlízy zachycené v komerčních sazenicích. Tyto hlízy byly pěstovány zpravidla na polích s dobrou zemědělskou technologií a intenzivní chemickou ochranou. Genotypy izolátů, které ovlivnily hlízy, jsou přizpůsobeny vývoji jejich vlastní odrůdy. Tyto kmeny jsou pro komerční výsadbu výrazně nebezpečnější než inokulum pocházející ze soukromých zahrad. Výsledky našich studií tento předpoklad rovněž podporují. Populace izolované z velkých polí se správně prováděnou chemickou ochranou a dobrou zemědělskou technologií se neliší ve vysoké genotypové rozmanitosti. Často se jedná o několik klonálních linií, které jsou vysoce agresivní.
Kmeny z komerčního semenného materiálu mohou vstoupit do populací v zeleninových zahradách a zapojit se do procesů v nich probíhajících. V zeleninové zahradě však bude jejich konkurenceschopnost mnohem nižší než v komerční oblasti a brzy přestanou existovat ve formě klonální linie, ale jejich geny lze použít v „zahradní“ populaci.
Infekce, která se během sklizně vyvíjí na „dobrovolných“ rostlinách a na hromadách vyřazených hlíz, není pro Rusko tak relevantní, protože V hlavních oblastech pěstování brambor v Rusku je pozorováno hluboké zimní zamrzání půdy a rostliny z hlíz, které v půdě zimovaly, se zřídka vyvíjejí. Jak navíc ukazují naše experimenty, patogen plísně nepřežije při negativních teplotách ani na hlízách, které si zachovaly svoji životaschopnost. V suché oblasti, kde se pěstuje rané brambory, je pozdní plíseň kvůli suchému a horkému vegetačnímu období poměrně vzácná.
Aktuálně tedy pozorujeme rozdělení populací P. infestans na populace „polní“ a „zahradní“. V posledních letech však byly pozorovány procesy vedoucí ke konvergenci a interpenetraci genotypů z těchto populací.
Mezi nimi lze zmínit obecné zvýšení gramotnosti malých producentů, vzhled cenově dostupných malých balení sadbových brambor, šíření fungicidních přípravků v malých baleních a ztrátu strachu z „chemie“ obyvatel.
Nastávají situace, kdy jsou díky intenzivní činnosti jednoho dodavatele celé vesnice osázeny hlízami stejné odrůdy a opatřeny malými baleními stejných pesticidů. Lze předpokládat, že brambory stejné odrůdy najdete na komerčních výsadbách poblíž.
Na druhé straně některé společnosti obchodující s pesticidy podporují „rozpočtové“ programy chemického ošetření. V tomto případě je počet doporučených ošetření podceňován a jsou nabízeny nejlevnější fungicidy a důraz není kladen na prevenci rozvoje pozdní plísně až po sekání vrcholků, ale na určité zpoždění epifytotypu za účelem zvýšení úrody. Taková schémata jsou ekonomicky oprávněná při pěstování konzumních brambor z méně kvalitního semenného materiálu, když v zásadě nejde o získání vysokého výnosu. V tomto případě však na rozdíl od populací zahrad přispívá vyrovnané genetické pozadí brambor k výběru specifických fyziologických ras, které jsou pro tuto odrůdu velmi nebezpečné.
Obecně se nám tendence ke sbližování „zahradních“ a „polních“ metod produkce brambor zdají poněkud nebezpečné. Aby se zabránilo jejich negativním důsledkům jak v domácím, tak v komerčním sektoru, bude nutné kontrolovat jak sortiment sadbových brambor, tak řadu fungicidů nabízených soukromým vlastníkům v malých obalech, jakož i sledování systémů ochrany brambor a používání fungicidních přípravků v komerčním sektoru.
V oblastech soukromého sektoru dochází k intenzivnímu rozvoji nejen plísně pozdní, ale i Alternaria. Většina majitelů soukromých pozemků nepřijímá zvláštní opatření na ochranu proti Alternaria, zaměňuje vývoj Alternaria za přirozené vadnutí vrcholků nebo rozvoj pozdní plíseň. Díky masivnímu rozvoji Alternaria na náchylných odrůdách proto mohou pozemky pro domácnosti sloužit jako zdroj inokula pro komerční výsadby.
Mechanismy variability
Mutační proces
Vzhledem k tomu, že výskyt mutací je náhodný proces probíhající s nízkou frekvencí, závisí výskyt mutací v jakémkoli místě na frekvenci mutací tohoto místa a velikosti populace. Při studiu frekvence mutací kmenů P. infestans se obvykle stanoví počet kolonií pěstovaných na selektivních živných médiích po ošetření chemickými nebo fyzickými mutageny. Jak je patrné z údajů uvedených v tabulce 8, může se frekvence mutací stejného kmene na různých lokusech lišit o několik řádů. Vysoká frekvence mutací rezistence na metalaxyl může být jedním z důvodů akumulace kmenů rezistentních na tuto metodu v přírodě.
Frekvence spontánních nebo indukovaných mutací, vypočtená na základě laboratorních experimentů, ne vždy odpovídá procesům probíhajícím v přirozených populacích, a to z následujících důvodů:
1. U asynchronních jaderných štěpení není možné odhadnout frekvenci mutací na jednu jadernou generaci. Většina experimentů proto poskytuje informace pouze přímo o frekvenci mutací, aniž by rozlišovala mezi dvěma mutačními událostmi a jednou událostí po mitóze.
2. Jednostupňové mutace obvykle snižují rovnováhu genomu, proto se spolu se získáním nové vlastnosti snižuje celková kondice organismu. Většina experimentálně získaných mutací má sníženou agresivitu a není zaznamenána v přirozených populacích. Korelační koeficient mezi stupněm rezistence mutantů P. infestans na fenylamidové fungicidy a rychlostí růstu na umělém médiu byl tedy v průměru (-0,62) a odolností vůči fungicidům a agresivitě na listech brambor (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), což naznačuje nízkou zdatnost mutantů. Mutace rezistence na dimethomorf byly také doprovázeny prudkým poklesem životaschopnosti (Bagirova et al., 2001).
3. Většina spontánních a indukovaných mutací je recesivních a v experimentech se neprojevují fenotypicky, ale představují skrytou rezervu variability v přirozených populacích. Mutantní kmeny izolované v laboratorních experimentech nesou dominantní nebo semi-dominantní mutace (Kulish a Dyakov, 1979). Zdá se, že jaderná diploidie vysvětluje neúspěšné pokusy o získání mutantů pod vlivem UV záření, které jsou virulentní u dříve rezistentních odrůd (McKee, 1969). Podle autorových výpočtů se takové mutace mohou vyskytovat s frekvencí menší než 1: 500000 XNUMX. K přechodu recesivních mutací na homozygotní, fenotypicky exprimovaný stav může dojít v důsledku sexuální nebo nepohlavní rekombinace (viz níže). I v tomto případě však může být mutace maskována dominantními alelami jader divokého typu v cenotickém (vícejaderném) myceliu a fenotypicky fixována pouze během tvorby mononukleárních zoospor.
Tabulka 8. Frekvence mutací P. infestans na látky inhibující růst působením nitrosomethylmočoviny (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Spojení | Frekvence mutací |
Oxytetracyklin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10 -8 |
Streptomycin | 8,3 x10-8 |
Trichothecin | 1,8 10 x-8 |
Cykloheximid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Velikost populace také hraje rozhodující roli při výskytu spontánních mutací. U velmi velkých populací, kde počet buněk N> 1 / a, kde a je rychlost mutace, přestává být mutace náhodným jevem (Kvitko, 1974).
Výpočty ukazují, že při průměrném napadení bramborového pole (35 skvrn na rostlinu) se na jednom hektaru denně vytvoří 8x1012 spor (Dyakov a Suprun, 1984). Zdá se, že takové populace obsahují všechny mutace povolené typem výměny v každém místě. Dokonce i vzácnou mutaci vyskytující se s frekvencí 10-9 získá tisíc jedinců z milionů žijících na jednom hektaru bramborového pole. U mutací vyskytujících se s vyšší frekvencí (například 10-6) se mohou v takové populaci (současně na dvou lokusech) denně vyskytovat různé párové mutace. proces mutace nahradí rekombinaci.
Migrace
U P. infestans jsou známy dva hlavní typy migrace: uzavření vzdáleností (na bramborovém poli nebo sousedních polích) šířením zoosporangií vzdušnými proudy nebo dešťovým postřikem a na velké vzdálenosti - výsadbou hlíz nebo přepravovaných plodů rajčat. První metoda zajišťuje rozšíření ohniska nemoci, druhá - vytvoření nových ohnisek v místech vzdálených od primárního.
Šíření infekce hlízami a plody rajčete nejen přispívá ke vzniku choroby na nových místech, ale je také hlavním zdrojem genetické rozmanitosti populací. V Moskevské oblasti se pěstují brambory dovážené z různých oblastí Ruska a západní Evropy. Plody rajčat se dovážejí z jižních oblastí Ruska (Astrachanská oblast, Krasnodarská oblast, Severní Kavkaz). Semena rajčat, která mohou sloužit také jako zdroje infekce (Rubin et al., 2001), se také dovážejí z jižních oblastí Ruska, Číny, evropských zemí a dalších zemí.
Podle výpočtů E. Mayra (1974) genetické změny v místní populaci způsobené mutacemi zřídka přesahují 10-5 na lokus, zatímco u otevřených populací je výměna v důsledku protiproudu genů nejméně 10-3 - 10-4.
Migrace v infikovaných hlízách je zodpovědná za vstup P. infestans do Evropy a šíří se do všech oblastí světa, kde se pěstují brambory; způsobily nejzávažnější populační změny. Plíseň pozdní na bramborách se objevila na území Ruské říše téměř současně s jejím výskytem v západní Evropě.
Protože tato choroba byla poprvé zaznamenána v letech 1846-1847 v pobaltských státech a teprve v následujících letech se rozšířila v Bělorusku a severozápadních oblastech Ruska, je zřejmý její západoevropský původ. První zdroj pozdní plíseň ve Starém světě není tak zřejmý. Hypotéza vyvinutá Frym a kol. (Fry a kol., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin a kol., 1994) naznačuje, že parazit nejprve přišel z Mexika do Severní Ameriky, kde se rozšířil plodinami a poté byl transportován do západní Evropy (obr.7).
V důsledku opakovaného driftu (dvojitý účinek „úzkého místa“) se do Evropy dostaly jednotlivé klony, jejichž potomci způsobili pandemii na celém území Starého světa, kde se pěstují brambory. Jako důkaz pro tuto hypotézu autoři uvádějí zaprvé všudypřítomný výskyt pouze jednoho typu páření (A1) a zadruhé homogenitu genotypů studovaných kmenů z různých oblastí (všechny jsou založeny na molekulárních markerech, včetně 2 izozymových lokusů, vzorcích DNA otisků prstů a struktura mitochondriální DNA jsou identické a odpovídají klonu US-1 popsanému v USA). Některé údaje však vzbuzují pochybnosti alespoň o některých ustanoveních uvedené hypotézy. Analýza mitochondriální DNA P. infestans izolované z herbářových vzorků brambor infikovaných během prvního epifytotického období ve 40. letech 1. století ukázala, že se liší strukturou mitochondriální DNA z klonu US-2001, který tedy byl alespoň není jediným zdrojem infekce v Evropě (Ristaino et al, XNUMX).
Situace pozdní plíseň se znovu zhoršila v 80. letech XNUMX. století. Došlo k následujícím změnám:
1) Průměrná agresivita populace se zvýšila, což vedlo zejména k rozšířenému šíření nejškodlivější formy plísně pozdní - poškození řapíku a stonků.
2) Došlo k posunu v době výskytu pozdní plíseň na bramborách - od konce července do začátku července a dokonce do konce června.
3) Typ páření A2, který dříve ve Starém světě chyběl, se stal všudypřítomným.
Změnám předcházely dvě události: masivní používání nového fungicidu metalaxylu (Schwinn a Staub, 1980) a vznik Mexika jako světového vývozce brambor (Niederhauser, 1993). V souladu s tím byly předloženy dva důvody populačních změn - konverze páření pod vlivem metalaxylu (Ko, 1994) a masivní zavedení nových kmenů s infikovanými hlízami z Mexika (Fry a Goodwin, 1995). Přestože interkonverze typů páření pod vlivem metalaxylu byly získány nejen Ko, ale také v pracích prováděných v laboratoři Moskevské státní univerzity (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), je vhodnější druhá hypotéza. Spolu s výskytem druhého typu páření došlo k vážným změnám v genotypech ruských kmenů P. infestans, včetně neutrálních genů (izozym a lokusy RFLP), jakož i ve struktuře mitochondriální DNA. Komplex těchto změn nelze vysvětlit působením metalaxylu; došlo spíše k masivnímu importu nových kmenů z Mexika, které, jelikož bylo agresivnější (Kato et al., 1997), vytlačilo staré kmeny (US-1) a stalo se dominantní v populacích. Ke změně složení evropských populací došlo ve velmi krátké době - od roku 1980 do roku 1985 (Fry et al., 1992). Na území bývalého SSSR byly „nové kmeny“ nalezeny ve sbírkách z Estonska v roce 1985, tedy dříve než v Polsku a Německu (Goodwin et al., 1994). Naposledy byl „starý kmen US-1“ v Rusku izolován z infikovaných rajčat v Moskevské oblasti v roce 1993 (Dolgova et al., 1997). Také ve Francii byly „staré“ kmeny nalezeny ve výsadbě rajčat až do počátku 90. let, tedy poté, co dlouho zmizely na bramborách (Leberton a Andrivon, 1998). Změny v kmenech P. infestans ovlivnily mnoho zvláštností, včetně těch, které mají velký praktický význam, a zvýšily škodlivost pozdní plíseň.
Sexuální rekombinace
Aby sexuální rekombinace přispěla k variabilitě, je nutné zaprvé přítomnost dvou typů páření v populaci v poměru blízkém 1: 1, a zadruhé přítomnost počáteční variability populace.
Poměr typů páření se velmi liší u různých populací a dokonce i v různých letech u jedné populace (tabulka 9,10, 90). Důvody takových drastických změn ve frekvenci typů páření v populacích (jako například v Rusku nebo v Izraeli na počátku 2002. let minulého století) nejsou známy, předpokládá se však, že je to způsobeno zavedením konkurenceschopnějších klonů (Cohen, XNUMX).
Některé nepřímé údaje naznačují průběh sexuálního procesu v určitých letech a v určitých regionech:
1) Studie populací z moskevského regionu ukázaly, že u 13 populací, kde byl podíl typu páření A2 menší než 10%, byla celková genetická diverzita vypočtená pro tři loci izozymu 0,08 a u 14 populací, u nichž podíl A2 překročil 30%, genetická diverzita byla dvakrát tak vysoká (0,15) (Elansky et al., 1999). Čím vyšší je pravděpodobnost pohlavního styku, tím větší je genetická rozmanitost populace.
2) Vztah mezi poměrem typů páření v populacích a intenzitou tvorby oospór byl pozorován v Izraeli (Cohen et al., 1997) a v Holandsku
(Flier a kol., 2004). Naše studie ukázaly, že v populacích, kde izoláty typu páření A2 představovaly 62, 17, 9 a 6%, byly oospory nalezeny u 78, 50, 30 a 15% analyzovaných bramborových listů (se 2 nebo více skvrnami).
Vzorky se 2 nebo více skvrnami významně častěji obsahovaly oospory než vzorky s 1 skvrnou (32, respektive 14% vzorků) (Apryshko et al., 2004).
Oospory byly mnohem častější v listech střední a spodní vrstvy rostliny bramboru (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) V některých oblastech byly objeveny jedinečné genotypy, jejichž výskyt je spojen se sexuální rekombinací. V Polsku v roce 1989 a ve Francii v roce 1990 byly kmeny homozygotní pro
fosfát izomeráza (GPI 90/90). Protože dříve se po dobu 10 let setkalo pouze s 90/100 heterozygotů, je homozygotnost přičítána sexuální rekombinaci (Sujkowski et al., 1994). V Kolumbii (USA) jsou izoláty kombinující A2 s GPI 100/110 a A1 s GPI 100/100 běžné, ale na konci sezóny 1994 (16. srpna a 9. září) kmeny s rekombinantními genotypy (A1 GPI 100/110 a A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) U některých populací z Polska (Sujkowski et al., 1994) a severního Kavkazu (Amatkhanova et al., 2004) odpovídá distribuce lokusů DNA otisků prstů a lokusů alozymového proteinu Hardy-Weinbergově distribuci, což naznačuje
o vysokém podílu příspěvku sexuální rekombinace k variabilitě populací. V jiných oblastech Ruska nebyla nalezena žádná korespondence s Hardy-Weinbergovou distribucí v populacích, ale byla prokázána přítomnost vazebné nerovnováhy, což naznačuje převahu klonální reprodukce (Elansky et al., 1999).
5) Genetická diverzita (GST) mezi kmeny s různými typy páření (A1 a A2) byla nižší než mezi různými populacemi (Sujkowski et al., 1994), což nepřímo naznačuje sexuální křížení.
Příspěvek sexuální rekombinace k populační rozmanitosti zároveň nemůže být příliš vysoký. Tento příspěvek byl vypočítán pro populace moskevské oblasti (Elansky et al., 1999). Podle výpočtů Lewontina (1979) „rekombinace, která může produkovat nové varianty ze dvou lokusů s frekvencí nepřesahující součin jejich heterozygosit, se stane účinnou, pouze pokud jsou hodnoty heterozygosity pro obě alely již vysoké.“
S poměrem dvou typů párování, který je typický pro moskevský region, rovný 4: 1, bude frekvence rekombinace 0,25. Pravděpodobnost, že zkřížené kmeny budou heterozygotní pro dva ze tří studovaných lokusů isozymu ve studovaných populacích, byla 0,01 (2 kmeny ze 177). Pravděpodobnost výskytu dvojitých heterozygotů v důsledku rekombinace by proto neměla překročit jejich součin vynásobený pravděpodobností křížení (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tj. sexuální rekombinanti obvykle nespadají do studovaného vzorku kmenů. Tyto výpočty byly provedeny pro populace z Moskevské oblasti charakterizované relativně vysokou variabilitou. V monomorfních populacích, jako jsou ty sibiřské, nemůže sexuální proces, i když k němu dochází u jednotlivých populací, ovlivnit jejich genetickou rozmanitost.
Kromě toho je P. infestans charakterizován častým nesouosostem chromozomů v meióze, která vede k aneuploidii (Carter et al., 1999). Taková porušení snižují plodnost hybridů.
Parasexuální rekombinace, mitotická genová konverze
V experimentech spojování kmenů P. infestans s mutacemi rezistence na různé inhibitory růstu byl zjištěn vznik misolátů rezistentních na oba inhibitory (Shattock, Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Kmeny rezistentní ke dvěma inhibitorům růstu vznikly v důsledku heterokaryotizace mycelia a v tomto případě se štěpily během reprodukce mononukleárními zoosporami (Judelson, Ge Yang, 1998), nebo se neštěpily u monozoporporálních potomků, protože měly tetraploidní (jelikož původní izoláty jsou diploidní) jádra (K 1979). Heterozygotní diploidy se segregovaly na velmi nízké frekvenci v důsledku haploidizace, nedisjunkce chromozomů a mitotického křížení (Poedinok et al., 1982). Četnost těchto procesů by mohla být zvýšena pomocí určitých akcí na heterozygotní diploidy (například UV záření klíčících spor).
Ačkoli se tvorba vegetativních hybridů s dvojitou rezistencí vyskytuje nejen in vitro, ale také u hlíz brambor infikovaných směsí mutantů (Kulish et al., 1978), je poměrně obtížné posoudit roli parasexuální rekombinace při generování nových genotypů v populacích. Frekvence tvorby segregants v důsledku haploidizace, nedisjunkce chromozomů a mitotického přechodu bez zvláštních efektů je zanedbatelná (méně než 10-3).
Výskyt homozygotních segregants heterozygotních kmenů může být založen jak na mitotickém křížení, tak na mitotické genové konverzi, která se u P. sojae vyskytuje s frekvencí 3 x 10-2 až 5 x 10-5 na lokus, v závislosti na kmeni (Chamnanpunt et al. , 2001).
I když se četnost výskytu heterokaryonů a heterozygotních diploidů ukázala být nečekaně vysoká (dosahující desítek procent), k tomuto procesu dochází, pouze když jsou mutantní kultury získané ze stejného kmene spojeny. Při použití různých kmenů izolovaných z přírody k heterokaryotizaci nedochází (nebo se vyskytuje s velmi nízkou frekvencí) kvůli vegetativní nekompatibilitě (Poedinok a Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). V důsledku toho lze roli parasexuální rekombinace snížit pouze na intraklonální rekombinaci v heterozygotních jádrech a přechod jednotlivých genů do homozygotního stavu bez sexuálního procesu. Tento proces může mít epidemiologický význam u kmenů s recesivní nebo semi-dominantní mutací rezistence vůči fungicidům. Jeho přechod do homozygotního stavu v důsledku parasexuálního procesu zvýší odolnost nosiče mutace (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgrese genů
Heterotalické druhy Phytophthora jsou schopné křížení s tvorbou hybridních oospór (viz Vorob'eva a Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Přirozený hybrid dvou druhů Phytophthora byl tak agresivní, že ve Velké Británii zabil tisíce olší (Brasier et al., 1999). P. infestans se může vyskytovat u jiných druhů rodu (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum atd.) Na běžných hostitelských rostlinách a v půdě, ale v literatuře existuje jen málo informací o možnosti mezidruhových hybridů. Za laboratorních podmínek byly získány hybridy mezi P. infestans a P. Mirabilis (Goodwin a Fry, 1994).
Tabulka 9. Podíl kmenů P. infestans s typem páření A2 v různých zemích světa v období od roku 1990 do roku 2000 (podle údajů z otevřených literárních zdrojů a stránek www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Země | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
bělorusko | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgie | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvádor | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonsko | 8 (12) | ||||||||||
Anglie | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finsko | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francie | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Maďarsko | 72 (32) | ||||||||||
Irsko | 4 (145) | ||||||||||
Severní. Irsko | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nizozemsko | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norsko | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polsko | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландия | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Švédsko | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Čína | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbie | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabulka 10. Podíl kmenů P. infestans s typem páření A2 v různých zemích světa v období 2000 až 2011
Země | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Rakousko | 65 (83) | ||||||||||
bělorusko | 42 (78) | ||||||||||
Belgie | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Švýcarsko | 89 (19) | ||||||||||
česká republika | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Německo | 95 (53) | ||||||||||
Dánsko | 48 (52) | ||||||||||
Ekvádor | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonsko | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Anglie | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finsko | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francie | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Maďarsko | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Severní. Irsko | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nizozemsko | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norsko | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polsko | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландия | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Švédsko | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovensko | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazílie | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Čína | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamika genotypového složení populací
Ke změnám v genotypovém složení populací P. infestans může dojít pod vlivem migrace nových klonů z jiných regionů, zemědělských postupů (změna odrůd, aplikace fungicidů) a povětrnostních podmínek. Vnější vlivy ovlivňují odlišně klony v různých fázích životního cyklu; populace proto každoročně zažívají cyklické změny ve frekvencích genů podléhajících selekci v důsledku změny převládající role driftu a selekce genů.
Vliv odrůdy
Nové kultivary s účinnými geny pro vertikální rezistenci (R-geny) jsou silným selektivním faktorem, který vybírá klony s komplementárními geny virulence v populacích P. infestans. Při absenci nespecifické rezistence u odrůdy brambor, která inhibuje růst populace patogenů, dochází k procesu nahrazování dominantních klonů v populaci velmi rychle. Takže po rozšíření odrůdy Domodedovsky, která má gen rezistence R3 v moskevské oblasti, se frekvence klonů virulentních pro tuto odrůdu zvýšila z 0,2 na 0,82 za jeden rok (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Ke změně frekvencí genů virulence (patotypů) v populacích však dochází nejen pod vlivem pěstovaných odrůd brambor. Například v Bělorusku do roku 1977 dominovaly klony s geny virulence 1 a 4, což bylo způsobeno kultivací odrůd brambor s geny rezistence R1 a R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Na konci 70. let 2002. století se však objevily klony s různými geny virulence a jejich kombinací a geny komplementární rezistence nebyly nikdy použity při šlechtění brambor (geny extra virulence) (Ivanyuk et al., XNUMX). Důvodem vzniku těchto klonů je zjevně migrace infekčního materiálu z Mexika s bramborovými hlízami do Evropy. Doma se tyto klony vyvíjely nejen na pěstovaných bramborách, ale také na divokých druzích nesoucích různé geny rezistence; proto byla pro přežití v těchto podmínkách nutná kombinace mnoha genů virulence v genomu.
Pokud jde o odrůdy s nespecifickou rezistencí, snižují rychlost reprodukce patogenu a zpomalují vývoj jeho populací, což, jak již bylo zmíněno, je funkcí čísla. Protože agresivita je polygenní, klony obsahující větší počet genů pro „agresivitu“ se hromadí, čím dříve, tím vyšší je velikost populace. Vysoce agresivní rasy proto nejsou produktem adaptace na kultivované odrůdy s nespecifickou rezistencí, ale naopak je pravděpodobnější, že budou detekovány ve výsadbách vysoce náchylných odrůd, které jsou akumulátory spór parazitů.
V Rusku tedy byly nejagresivnější populace P. Infestans nalezeny v zónách ročních epifytotií (populace z oblastí Sachalin, Leningrad a Brjansk). Ukázalo se, že agresivita těchto populací byla vyšší než u mexické populace (Filippov et al., 2004).
Kromě toho se v listech rezistentních odrůd vytváří méně oospór než u náchylných (Hanson a Shattock, 1998), to znamená, že nespecifická rezistence odrůdy také snižuje rekombinační schopnosti parazita a možnost alternativních metod zimování.
Vliv fungicidů
Fungicidy nejen snižují počet fytopatogenních hub, tj. ovlivnit kvantitativní charakteristiky jejich populací, ale mohou také změnit frekvence jednotlivých genotypů, tj. ovlivnit kvalitativní složení populace. Mezi nejdůležitější ukazatele populací měnících se pod vlivem fungicidů patří: změny odolnosti vůči fungicidům, změny agresivity a virulence a změny v chovných systémech.
Vliv fungicidů na odolnost a agresivitu populací
Stupeň tohoto vlivu je určen především typem použitého fungicidu, který lze podmíněně rozdělit na polysite, oligosit a monosit.
První zahrnuje většinu kontaktních fungicidů. Odpor vůči nim (pokud je to vůbec možné) je řízen velkým počtem velmi slabě expresivních genů. Tyto vlastnosti určují nepřítomnost viditelných změn v rezistenci populace po ošetření fungicidy (i když v některých experimentech bylo dosaženo určitého zvýšení rezistence). Populace hub konzervovaná postřikem kontaktními fungicidy sestává ze dvou skupin kmenů:
1) Kmeny konzervované v rostlinných oblastech neošetřených tímto lékem. Protože nedošlo k žádnému kontaktu s fungicidem, agresivita a odolnost těchto kmenů se nemění.
2) Kmeny v kontaktu s fungicidem, jejichž koncentrace v místech kontaktu byla nižší než smrtelná. Jak již bylo zmíněno výše, rezistence této části populace se také nemění, nicméně v důsledku částečného škodlivého účinku fungicidu dokonce i v subletální koncentraci na metabolismus buňky houby klesá obecná zdatnost a její parazitní složka, agresivita (Derevyagina a Dyakov, 1990).
Dokonce i část populace, která nezemřela, nebyla vystavena kontaktu s fungicidem, má slabou agresivitu a nemůže být zdrojem epifytotik. Podmínkou úspěchu ochranných opatření je proto pečlivé zpracování, které snižuje frekvenci podílu populace, která není ve styku s fungicidem. Odolnost vůči oligositovým fungicidům je řízena několika aditivními geny.
Mutace každého genu vede k určitému zvýšení rezistence a celkový stupeň rezistence je způsoben přidáním takových mutací. Proto ke zvýšení odporu dochází v krocích. Příkladem postupného zvyšování rezistence jsou mutace rezistence na fungicid dimethomorph, který se široce používá k ochraně brambor před plísní. Rezistence na dimethomorf je polygenní a aditivní. Jednostupňová mutace mírně zvyšuje odolnost.
Každá následující mutace zmenšuje velikost cíle a následně frekvenci následných mutací (Bagirova et al., 2001). Ke zvýšení průměrné rezistence populace po opakovaném působení oligositovým fungicidem dochází postupně a postupně. Rychlost tohoto procesu je dána nejméně třemi faktory: frekvencí mutací genů rezistence, koeficientem rezistence (poměr letální dávky rezistentního kmene k citlivému kmenu) a účinkem mutací genů rezistence na kondici.
Frekvence výskytu každé následující mutace je nižší než předchozí, proto má proces tlumící povahu (Bagirova et al., 2001). Pokud se však v populaci vyskytnou rekombinační procesy (sexuální nebo parasexuální), je možné kombinovat různé mutace rodičů v hybridním kmeni a proces urychlit. Populace panmixu proto získávají rezistenci rychleji než populace agamické a v druhé populaci, které nemají bariéry vegetativní nekompatibility rychleji než populace oddělené těmito bariérami. V tomto ohledu přítomnost kmenů v populacích, které se liší v typech páření, urychluje proces získávání rezistence vůči oligositovým fungicidům.
Druhý a třetí faktor nepřispívají k rychlé akumulaci kmenů rezistentních na dimethomorph v populacích. Každá následující mutace přibližně zdvojnásobuje rezistenci, což je nevýznamné, a zároveň snižuje jak rychlost růstu v umělém prostředí, tak agresivitu (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Možná i proto mezi přirozenými kmeny P. infestans neexistují prakticky žádné rezistentní kmeny, dokonce ani ty, které byly odebrány ze sadby brambor ošetřených dimethomorfem.
Populace ošetřená oligositovým fungicidem bude také sestávat ze dvou skupin kmenů: těch, které nebyly ve styku s fungicidem, a proto nezměnily původní vlastnosti (pokud se v této skupině naleznou rezistentní kmeny, nebudou se hromadit kvůli vyšší agresivitě a konkurenceschopnosti citlivých kmenů), a kmeny v kontaktu s subletálními koncentracemi fungicidu. Mezi nimi je možná akumulace rezistentních kmenů, protože zde mají výhody oproti citlivým.
Proto při použití oligositových fungicidů není tolik důležité důkladné ošetření jako vysoká koncentrace léčiva, několikanásobně vyšší než smrtelná dávka, protože při postupné mutagenezi je počáteční rezistence mutovaných kmenů nízká.
A konečně, mutace v rezistenci na monositické fungicidy jsou vysoce expresivní, to znamená, že jedna mutace může hlásit vysokou úroveň rezistence až do úplné ztráty citlivosti. Proto ke zvýšení odporu populace dochází velmi rychle.
Příkladem takových fungicidů jsou fenylamidy, včetně nejběžnějšího fungicidu metalaxyl. Mutace rezistence k němu se vyskytují s vysokou frekvencí a stupeň rezistence u mutantů je velmi vysoký - převyšuje citlivý kmen o faktor tisíc nebo více (Derevyagina et al., 1993). Ačkoli rychlost růstu a agresivita rezistentních mutantů klesá na pozadí smrti citlivých kmenů ze systémového fungicidu, počet rezistentních populací rychle roste a jejich agresivita paralelně roste. Agresivita rezistentních kmenů se tak po několika letech používání fungicidu může nejen vyrovnat agresivitě citlivých, ale také ji překonat (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Dopad na sexuální rekombinaci
Vzhledem k tomu, že častý výskyt typu páření A2 v populacích P. infestans se shodoval s intenzivním používáním metalaxylu proti pozdní plísni, bylo navrženo, že metalaxyl indukuje konverzi typu páření. U P. parasitica byla experimentálně prokázána taková přeměna působením chloronebu a metalaxylu (Ko, 1994). Jediná pasáž na médiu s nízkou koncentrací metalaxylu vedla ke vzniku homotalických izolátů z kmene P. infestans citlivého na metalaxylu s pářícím se typem A1 (Savenkova a Cherepnikova-Anikina, 2002). Během následných pasáží na médiu s vyšší koncentrací metalaxylu nebyl detekován ani jeden izolát typu párování A2, nicméně většina izolátů při křížení s izoláty A2 místo oporpor vytvořila ošklivé akumulace mycelia a byla sterilní. Průchody rezistentního kmene majícího spojovací typ A2 na médiu s vysokou koncentrací metalaxylu nám umožnily detekovat tři formy změn spojovacího typu: 1) úplná sterilita při křížení s izoláty A1 a A2; 2) homotallismus (tvorba oospór v monokultuře); 3) převod typu páření A2 na A1. Metalaxyl tedy může způsobit změny v typech páření v populacích P. infestans a v důsledku toho v nich výskyt sexuální rekombinace.
Vliv na vegetativní rekombinaci
Některé geny rezistence na antibiotika zvyšovaly frekvenci hyfální heterokaryotizace a nukleární diploidizace (Poedinok a Dyakov, 1981). Jak již bylo uvedeno výše, k heterokaryotizaci hyf během fúze různých kmenů P. infestans dochází velmi zřídka kvůli jevu vegetativní neslučitelnosti u této houby. Geny pro rezistenci na některá antibiotika však mohou mít vedlejší účinky, vyjádřené překonáním vegetativní nekompatibility. Tuto vlastnost vlastnil gen 1S-1 mutantní rezistence na streptomycin. Přítomnost takových mutantů v polních populacích phytophthory může zvýšit tok genů mezi kmeny a urychlit přizpůsobení celé populace novým odrůdám nebo fungicidům.
Určité fungicidy a antibiotika mohou ovlivnit frekvenci mitotické rekombinace, což může také změnit frekvence genotypů v populacích. Široce používaný fungicidní benomyl se váže na beta-tubulin, protein, ze kterého jsou vytvářeny mikrotubuly cytoskeletu, a tím narušuje procesy separace chromozomů v anafázi mitózy, čímž zvyšuje frekvenci mitotické rekombinace (Hastie, 1970).
Fungicid para-fluorfenylalanin, který se používá k léčbě nizozemských nemocí v jilmech, má stejnou vlastnost. Para-fluorfenylalanin také zvýšil frekvenci rekombinace u heterozygotních diploidů P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Cyklické změny v genotypovém složení populací v životním cyklu P. infestans
Klasický vývojový cyklus P. infestans v mírném pásmu se skládá ze 4 fází.
1) Fáze exponenciálního růstu populace (polycyklická fáze) s krátkými generacemi. Tato fáze obvykle začíná v červenci a trvá 1,5–2 měsíce.
2) Fáze zastavení růstu populace v důsledku prudkého poklesu podílu neovlivněné tkáně nebo nástupu nepříznivých povětrnostních podmínek. Tato fáze na farmách, které provádějí předsklizňové odstraňování listů, z ročního cyklu odpadá.
3) Fáze zimování na hlízách, doprovázená významným snížením populace v důsledku náhodné infekce hlíz, pomalým vývojem infekce v nich, absencí opětovné infekce hlíz, hnilobou a utracením postižených hlíz za normálních skladovacích podmínek.
4) Fáze pomalého vývoje v půdě a na sazenicích (monocyklická fáze), ve které může doba generace dosáhnout měsíce nebo více (konec května - začátek července). Obvykle je v této době obtížné odhalit nemocné listy, a to i při zvláštních pozorováních.
Fáze exponenciálního populačního růstu (polycyklická fáze)
Četná pozorování (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) ukázaly, že na počátku epifytoty převládají nízko virulentní a mírně agresivní klony, které jsou následně nahrazeny virulentnějšími a agresivnějšími. rychlost růstu agresivity populace je tím vyšší, čím méně odolná je odrůda hostitelské rostliny.
Jak populace roste, zvyšuje se koncentrace jak selektivně důležitých genů zavedených do komerčních odrůd (R1-R4), tak selektivně neutrálních (R5-R11). V populacích poblíž Moskvy v roce 1993 tedy průměrná virulence od konce července do poloviny srpna vzrostla z 8,2 na 9,4 a největší nárůst byl pozorován u selektivně neutrálního genu virulence R5 (z 31 na 86% virulentních klonů) (Smirnov, 1996 ).
Snížení rychlosti růstu populace je doprovázeno snížením parazitní aktivity populace. Proto je v depresivních letech celkový počet ras a podíl vysoce virulentních ras nižší než u epifytotických (Borisenok, 1969). Pokud se na vrcholu epifytotických povětrnostních podmínek změní na nepříznivé pro pozdní plíseň a napadení brambor se sníží, sníží se také koncentrace vysoce virulentních a agresivních klonů (Rybakova et al., 1987).
Zvýšení frekvencí genů ovlivňujících virulenci a agresivitu populace může být způsobeno výběrem virulentnějších a agresivnějších klonů ve smíšené populaci. Pro demonstraci selekce byla vyvinuta metoda pro analýzu neutrálních mutací, která byla úspěšně použita v populacích chemostatů kvasinek (Adams et al., 1985) a Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Četnost mutantů rezistentních na blasticidin S v polní populaci P. infestans se snižovala souběžně s růstem agresivity populace, což naznačuje změnu dominantních klonů během růstu populace (Rybakova et al., 1987).
Fáze zimování na hlízách
Během zimování v hlízách brambor virulence a agresivita kmenů P. infestans klesá a pokles virulence nastává pomaleji než agresivita (Rybakova a Dyakov, 1990). Zdá se, že za podmínek vedoucích k rychlému růstu populace (r-selekce) jsou „extra“ geny virulence a vysoká agresivita užitečné, proto je vývoj epifytotik doprovázen výběrem těch nejvirulentnějších a agresivnějších klonů. V podmínkách nasycení prostředí, kdy nehraje důležitou roli rychlost reprodukce, ale přetrvávání existence v nepříznivých podmínkách (K-výběr), „extra“ geny virulence a agresivity snižují kondici a klony s těmito geny vymírají jako první, takže průměrná agresivita a virulence populace klesá.
Vegetační fáze v půdě
Tato fáze je nejzáhadnější v životním cyklu (Andrivon, 1995). Jeho existence byla postulována čistě spekulativně - kvůli nedostatku informací o tom, co se s patogenem děje po dlouhou dobu (někdy i déle než měsíc) - od vzniku sazenic brambor po výskyt prvních skvrn nemoci na nich. Na základě pozorování a experimentů bylo rekonstruováno chování houby v tomto období života (Hirst a Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulace houby se může tvořit na infikovaných hlízách v půdě. Výsledné spory klíčí s hyfami, které mohou v půdě dlouho vegetovat. Primární (vytvořené na hlízách) a sekundární (na myceliu v půdě) spóry stoupají na povrch půdy kapilárními proudy, ale schopnost infikovat brambory získávají až poté, co jejich spodní listy sestoupí a přijdou do kontaktu s povrchem půdy. Takové listy (jmenovitě se na nich nacházejí první skvrny nemoci) se netvoří okamžitě, ale po prodlouženém růstu a vývoji vrcholků brambor.
V životním cyklu P. infestans tedy může také existovat saprotrofická vegetační fáze. Pokud je v parazitické fázi životního cyklu agresivita nejdůležitější složkou fitness, pak je v saprotrofické fázi výběr zaměřen na snížení parazitických vlastností, jak je experimentálně prokázáno u některých fytopatogenních hub (viz Carson, 1993). V této fázi cyklu by proto měly být agresivní vlastnosti ztraceny nejintenzivněji. Doposud však nebyly provedeny žádné přímé experimenty, které by potvrdily výše uvedené předpoklady.
Sezónní změny ovlivňují nejen patogenní vlastnosti P. infestans, ale také odolnost vůči fungicidům, které rostou v polycyklické fázi (během epifytotií) a snižují se během zimního skladování (Derevyagina et al., 1991; Kadish a Cohen, 1992). Obzvláště intenzivní pokles odolnosti vůči metalaxylu byl pozorován v období mezi výsadbou postižených hlíz a výskytem prvních skvrn nemoci na poli.
Intraspecifická specializace a její vývoj
P. infestans způsobuje epidemie u dvou komerčně významných plodin, brambor a rajčat. Epifytózy na bramborách začaly brzy poté, co se houba dostala do nových oblastí. Porážka rajčat byla zaznamenána také krátce po objevení infekce na bramborách, ale epifytózy na rajčatech byly zaznamenány až o sto let později - v polovině XNUMX. století. Zde je to, co Hallegli a Niederhauser píší o porážce rajčat v USA
(1962): „Asi 100 let po těžké epifytotypii z roku 1845 bylo provedeno jen málo nebo téměř žádné pokusy o získání rezistentních odrůd rajčat. Ačkoli pozdní plíseň byla poprvé zaznamenána na rajčatech již v roce 1848, stala se předmětem vážné pozornosti chovatelů této rostliny až do silného propuknutí choroby v roce 1946. Na území Ruska byla v 60. století registrována pozdní rajče. "Vědci dlouho této nemoci nevěnovali pozornost, protože nezpůsobila významné ekonomické škody." Ale v 70. a 1979. letech. V SSSR jsou pozorovány epifytózy XX.
Od té doby se plíseň pozdní plíseň stala každoročně, rozšířila se po celém území průmyslového a domácího pěstování a způsobuje této plodině obrovské ekonomické škody. Co se stalo? Proč se první výskyt parazita na bramborách a epifytotická léze této plodiny vyskytly téměř současně a proč trvalo století, než se epifytotikum objevilo na rajčatech? Tyto rozdíly podporují spíše mexický než jihoamerický zdroj infekce. Pokud se druh Phytophthora infestans vytvořil jako parazit mexických hlízonosných druhů rodu Solanum, je pochopitelné, proč byly pěstované brambory patřící do stejné části rodu jako mexický druh tak silně ovlivněny, ale kvůli absenci společného vývoje s parazitem, který nevyvinul mechanismy specifické a nespecifické rezistence.
Rajčata patří do jiné části rodu, druh její výměny se významně liší od hlíznatých druhů, proto navzdory skutečnosti, že rajče není mimo potravinovou specializaci P. infestans, intenzita jeho poškození nebyla dostatečná pro vážné ekonomické ztráty.
Vznik epifytotií na rajčatech je způsoben vážnými genetickými změnami parazita, které při parazitování zvýšily jeho adaptabilitu (patogenitu). Věříme, že novou formou specializovanou na parazitování na rajčatech je rasa T1 popsaná M. Galleglym, která ovlivňuje odrůdy cherry rajčat (Red Cherry, Ottawa), odolné vůči rase T0 rozšířené na bramborách (Gallegly, 1952). Zdá se, že mutace (nebo řada mutací), která změnila závod T0 na závod T1 a vedla k objevení klonů vysoce přizpůsobených porážce rajčete. Jak se často stává, zvýšení patogenity u jednoho hostitele bylo doprovázeno poklesem u jiného hostitele, to znamená, že vznikla počáteční, dosud úplná vnitrodruhová specializace - na brambory (rasa T0) a na rajče (rasa T1).
Jaké jsou důkazy pro tento předpoklad?
- Výskyt na bramborách a rajčatech. Na listech rajčat převládá rasa T1, zatímco na listech bramborových je vzácná. Podle S.F.Bagirova a T.A. Oreshonkova (nepublikováno) v Moskevské oblasti v letech 1991-1992 byl výskyt závodu T1 ve výsadbě brambor 0% a ve výsadbě rajčat - 100%; v letech 1993-1995 - 33%, respektive 90%; v roce 2001 - 0% a 67%. Podobné údaje byly získány v Izraeli (Cohen, 2002). Pokusy s infekcí hlíz bramboru izoláty rasy T1 a směsí izolátů T0 a T1 ukázaly, že izoláty rasy T1 jsou v hlízách špatně konzervovány a jsou nahrazeny izoláty rasy T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamika závodu T1 ve výsadbě rajčat. Primární infekce rajčatových listů se provádí izoláty rasy T0, které dominují v analýze infekce v prvních skvrnách vytvořených na listech. To potvrzuje obecně přijímané schéma migrace parazitů: Hlavní množství infekce z brambor je způsobeno rasou T0, avšak malý počet klonů T1 konzervovaných v bramborách, jednou na rajčatech, přemístí rasu T0 a hromadí se na konci epifytotického období. Je také možné, že u rasy T1 existuje alternativní zdroj infekce rajčatovými listy, který není tak silný jako bramborové hlízy a listy, ale je stálý. Tento zdroj má tedy slabý vliv na genetickou strukturu populace infikující rajče, ale následně určuje akumulaci rasy T1 (Rybakova, 1988; Dyakov a kol., 1994).
3) Agresivita na brambory a rajčata. Umělá infekce rajčat a listů brambor izoláty ras T0 a T1 ukázala, že první jsou agresivnější pro brambory než pro rajčata a druhé jsou agresivnější pro rajčata než pro brambory. Tyto rozdíly se projevují ve vytěsňování izolátů ne „vlastní“ rasy ze smíšené populace během listových pasáží ve skleníku (D'yakov et al., 1975) a na polních polích (Leberton et al., 1999); rozdíly v minimální infekční zátěži, době latence, velikosti infekčních skvrn a produkci spor (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Agresivita izolátů rasy T1 vůči odrůdám rajčat postrádajících geny rezistence je tak vysoká, že tyto izoláty spórují na listech jako na živném médiu bez nekrotizace infikované tkáně (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulence pro brambory a rajčata. Rasa T1 ovlivňuje odrůdy cherry rajčat s genem rezistence Ph1, zatímco rasa T0 není schopna tyto odrůdy infikovat, tj. má užší virulenci. Ve vztahu k derivátorům
R-geny brambor jsou nepřímo příbuzné, tj. kmeny izolované z listů rajčete jsou méně virulentní než kmeny „brambor“ (tabulka 11).
5) Neutrální značky. Analýza neutrálních markerů v populacích P. infestans parazitujících na bramborách a rajčatech také svědčí o vícesměrné vnitrodruhové selekci. V brazilských populacích P. infestans patřily izoláty rajčatových listů do klonální linie US-1 a izoláty z bramborových listů do linie BR-1 (Suassuna et al., 2004). Na Floridě (USA) začal od roku 1994 dominovat klon US-90 na bramborách (s výskytem více než 8%) a klony US-11 a US-17 na rajčatech a jejich izoláty jsou agresivnější pro rajčata než pro brambory (Weingartner , Tombolato, 2004). Byly zjištěny významné rozdíly ve frekvencích genotypů (otisky prstů DNA) u izolátů brambor a rajčat u 1200 kmenů P. infestans shromážděných ve Spojených státech od roku 1989 do roku 1995 (Deahl et al., 1995).
Pomocí metody AFLP bylo možné oddělit 74 kmenů odebraných z brambor a listů rajčat v letech 1996-1997. ve Francii a Švýcarsku, v 7 skupinách. Kmeny brambor a rajčat se jasně nelišily, ale kmeny „brambor“ byly geneticky rozmanitější než kmeny „rajčat“. První byly nalezeny ve všech sedmi shlucích a druhá pouze ve čtyřech, což naznačuje specializovanější genom druhé skupiny (Knapova a Gisi, 2002).
6) Mechanismy izolace. Pokud se populace parazita na dvou hostitelských rostlinných druzích vyvine směrem ke zúžení specializace na jejich „vlastního“ hostitele, pak vzniknou různé pre- a postmeiotické mechanismy, které brání vzájemné populační genetické výměně (Dyakov a Lekomtseva, 1984).
Několik studií zkoumalo vliv zdroje rodičovských kmenů na účinnost hybridizace. Při křížení kmenů izolovaných z různých druhů rodu Solanum v Ekvádoru (Oliva et al., 2002) bylo zjištěno, že kmeny s pářením typu A2 z divokých Solanaceae (klonální linie EC-2) jsou nejhorší kříženy s kmeny z rajčat (linie EC -3) a nejúčinnější křížení s kmenem brambor (EC-1).
Bylo zjištěno, že všechny hybridy nejsou patogenní. Autoři se domnívají, že nízké procento hybridizace a snížení patogenity hybridů je způsobeno postmeiotickými mechanismy reprodukční izolace populací.
V experimentech Bagirova et al. (1998) bylo zkříženo velké množství kmenů brambor a rajčat s vlastnostmi ras T0 a T1. Nejúrodnější byly křížení kmenů T1xT1 izolované z rajčat (36 oospor v zorném poli mikroskopu, 44% klíčení oospór), nejméně účinné byly křížení ras T0xT1 izolované od různých hostitelů (nízký počet vyvíjejících se a vyklíčených oporpor, vysoký podíl neúspěšných a málo rozvinutých oporpor) ... Účinnost křížení mezi izoláty rasy T0 izolovaných z brambor byla střední. Vzhledem k tomu, že hlavní část kmenů rasy T0 ovlivňuje brambory, má spolehlivý zdroj zimování - bramborové hlízy, v důsledku čehož je význam oospor jako zimních infekčních jednotek pro populace brambor nízký. Přizpůsobená „rajčatová forma“ je schopna zimovat na rajčatech ve formě oospór (viz níže), a proto si zachovává vyšší produktivitu sexuálního procesu. Díky své vysoké plodnosti získává T1 nezávislý potenciál pro primární infekci u rajčat. Výsledky získané Knapovou a kol. (Knapova a kol., 2002) lze interpretovat stejným způsobem. Kříže kmenů izolovaných z brambor s kmeny rajčat poskytly nejvyšší počet oospór - 13,8 na m5. střední (s rozpětím 19-6,3) a střední procento klíčivosti oospór (0 s rozpětím 24-7,6). Křížení kmenů izolovaných z rajčat poskytlo nejnižší procento oospór (4 s rozpětím 12–10,8) s nejvyšším procentem jejich klíčivosti (8,6). Křížení mezi kmeny izolovanými z brambor poskytlo střední počet oospór (0 s vysokým rozptylem dat - 30-2,7) a nejnižší procento klíčivosti oospór (90). Kmeny z brambor jsou tedy méně úrodné než kmeny z rajčat, ale křížení mezi populacemi nepřineslo horší výsledky než intrapopulační. Je možné, že rozdíly s výše uvedenými údaji Bagirova et al. jsou vysvětleny skutečností, že ruští vědci pracovali s kmeny izolovanými na počátku 90. let XNUMX. století a švýcarští vědci - s kmeny izolovanými na konci XNUMX. let.
Základem nízké plodnosti může být heteroploidie kmenů. Pokud je v mexických populacích, kde jsou sexuální procesy a primární infekce potomky oospór pravidelné, většina studovaných kmenů P. Infestans diploidní, pak je v zemích Starého světa pozorován intrapopulační polymorfismus ploidie (di-, tri- a tetraploidní kmeny, stejně jako heterokaryotické kmeny s heteroploidními jádry) a kmeny mající různé typy páření, tj. vzájemně plodné, liší se jadernou ploidií (Therrien a kol., 1989, 1990; Whittaker a kol., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Důvodem nízké plodnosti může být rozmanitost jader v anteridiích a oogoniích.
Pokud jde o jaderné výměny mezi hyfami během anastomóz, tomu brání vegetativní nekompatibilita, která rozděluje nepohlavní populace do mnoha geneticky izolovaných klonů (Poedinok a Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergence populací. Výše uvedená data naznačují, že je možná hybridizace mezi kmeny „brambor" a „rajčat" P. infestans. Je také možné vzájemné opětovné infikování různých hostitelů, i když se sníženou agresivitou.
Studie populačních markerů na izolátech ze sousedních bramborových a rajčatových polí v roce 1993 ukázala, že asi čtvrtina izolátů izolovaných z listů rajčat byla přenesena ze sousedního bramborového pole (Dolgova et al., 1997). Teoreticky lze předpokládat, že divergence populací na dvou hostitelích se zvýší a povede ke vzniku specializovaných vnitrodruhových forem (f.sp. brambor a f.sp. rajče), zejména proto, že oospory mohou přetrvávat v rostlinných zbytcích (Drenth et al., 1995) Bagirova, Dyakov, 1998) a semena rajčat (Rubin et al., 2001). V důsledku toho mají rajčata v současnosti zdroj jarní regenerace nezávisle na hlízách brambor.
Všechno se však stalo jinak. Zimování oospórami umožnilo parazitovi vyhnout se nejužšímu stádiu jeho životního cyklu - monocyklickému stádiu vegetace v půdě, během kterého se snižují parazitické vlastnosti, které se v létě postupně obnovují v polycyklické fázi.
Tabulka 11. Frekvence genů virulence u odrůd diferenciace brambor u kmenů P. infestans
Země | Rok | Průměrný počet genů virulence v kmenech | Autor | |
z brambor | z rajčat | |||
Francie | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francie, Švýcarsko | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapová, Gisi, 2002 |
United States | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin a kol., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance a kol., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvádor | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun a kol., 1998 |
Izrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusko, Mosk. kraj | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusko, různé regiony | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya a další. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primární zoosporangie a zoospory, které klíčí oospory, mají vysoký stupeň parazitické aktivity, zejména pokud byly oospory formovány parthenogeneticky pod vlivem feromonů kmene s opačným typem páření. Proto je infekční materiál na sazenicích rajčat pěstovaných ze semen infikovaných oospory vysoce patogenní pro rajčata i brambory.
Tyto změny vedly k další restrukturalizaci populace, vyjádřené v následujících důležitých změnách z epidemiologického hlediska:
- Infikované sazenice rajčat se staly důležitým zdrojem primární infekce brambor (Filippov, Ivanyuk, osobní zprávy).
- Epifytózy na bramborách začaly být pozorovány již v červnu, přibližně o měsíc dříve než obvykle.
- V sadbě brambor vzrostlo procento rasy T1, se kterou se tam dříve setkalo v nevýznamném množství (Ulanova et al., 2003).
- Kmeny izolované z rajčatových listů se již nelišily od kmenů brambor virulencí na bramborových derivátech genů virulence a začaly agresivně převyšovat „bramborové“ kmeny nejen na rajčatech, ale i na bramborách (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Místo divergence tedy došlo ke konvergenci populací, vzniku jediné populace na dvou hostitelských rostlinách s vysokou virulencí a agresivitou pro oba druhy.
Závěr
I přes více než 150 let intenzivního studia P. infestans, v biologii, včetně populační biologie tohoto původce nejdůležitějších chorob kultivovaných rostlin solanace, zůstává mnoho neznámých. Není jasné, jak přechod jednotlivých stádií životního cyklu ovlivňuje strukturu populací, jaké jsou genetické mechanismy kanalizované variability agresivity a virulence, jaký je poměr reprodukčních a klonálních reprodukčních systémů v přírodních populacích, jak se dědí vegetativní neslučitelnost, jaká je role brambor a rajčat při primární infekci těchto plodin a při jaký je jejich účinek na populační strukturu parazita. Doposud nebyly vyřešeny takové důležité praktické problémy, jako jsou genetické mechanismy pro změnu agresivity parazita nebo eroze nespecifické rezistence brambor. S prohlubováním a rozšiřováním výzkumu bramborové pozdní plíseň představuje parazit pro výzkumníky nové výzvy. Zlepšení experimentálních schopností, vznik nových metodických přístupů k manipulaci s geny a proteiny nám však umožňují doufat v úspěšné řešení položených otázek.
Článek byl publikován v časopise „Potato Protection“ (č. 3, 2017)